胆管上皮细胞类器官模型的探索：氯丙嗪对胆管细胞的毒性作用研究

文章介绍

2024年3月21日，荷兰乌得勒支药学研究所在期刊Stem Cell Research & Therapy（IF:7.4996）发表了一篇题为“Cholangiocyte organoids to study drug-induced injury”的文章。

#1

摘要

Abstract

药物引起的胆管损伤是一种常见的临床问题，它会导致一系列广泛的病理特征。在过去的几十年里，已经确定了多种与胆管损伤相关的药物，但这些药物的作用机制大多仍然不明确。本研究发现，CPZ通过降低紧密连接蛋白1（TJP1）、E-钙粘蛋白1（CDH1）和赖氨酰氧化酶同源物2（LOXL2）的表达水平，导致单层细胞完整性丧失。CPZ暴露后，通过免疫染色证实了zonula occuludens-1（ZO-1）和E-钙粘蛋白的丢失，而罗丹明-123的泄漏进一步证实了胆管上皮细胞屏障功能的破坏。此外，氧化应激似乎在CPZ引起的早期损伤反应中起主要作用。CPZ还降低了三种主要的基底外侧胆汁酸转运蛋白——ABCC3（ATP结合盒亚家族C成员3）、SLC51A/B（溶质载体家族51亚单位α/β）和多药耐药转运蛋白ABCB1（ATP结合盒亚家族B成员1）的表达，从而导致胆汁酸积累。虽然CPZ本身并未引起炎症反应，但添加TNFα后显示出协同作用。这些结果表明，ICOs可作为鉴定影响胆管的毒性药物的模型，并为肝毒性机制提供深入见解。

#2

研究方法

Methods

本研究利用先进的体外胆管上皮细胞培养技术，探讨了氯丙嗪（CPZ）引起胆管损伤的机制。我们将肝内胆管上皮细胞类器官（ICOs）分化为成熟的胆管上皮细胞样细胞（CLCs），并通过添加胆汁酸混合物，在胆汁淤积或非胆汁淤积的条件下，将这些细胞暴露于CPZ。

#3

主要结果

Results

类器官暴露于氯丙嗪和胆汁酸的毒性随时间和浓度变化

本研究探讨了不同时间和浓度下，胆管上皮细胞类器官（CLCOs）暴露于氯丙嗪（CPZ）和胆汁酸（BAs）时的毒性作用。研究者在不同浓度CPZ下，对CLCOs进行了非胆汁淤积或胆汁淤积条件（有无胆汁酸混合物）的处理，持续时间为24小时和72小时。他们使用AlamarBlue试剂测定细胞活力，通过LDH测定法评估细胞毒性。

研究结果显示，CPZ处理导致CLCOs的浓度依赖性毒性，较高浓度的CPZ引起更明显的细胞毒性作用。此外，胆汁酸混合物的存在影响了毒性水平，表明CPZ和BAs之间可能存在相互作用，共同诱导细胞损伤。该研究强调了评估药物对胆管上皮细胞类器官毒性时，需同时考虑药物浓度和其他化合物（如胆汁酸）的存在。这些发现为药物引起的胆管损伤机制提供了有价值的见解，并强调了使用先进体外模型（如胆管上皮细胞类器官）研究此类现象的重要性。

图1 胆管上皮细胞类器官（CLCOs）对氯丙嗪（CPZ）和胆汁酸（BAs）的敏感性。A. 将CLCOs与不同浓度的氯丙嗪（0、30、50、80和160 μM）孵育24、48和72小时后的形态。比例尺＝100µm。B、C. 将CLCOs暴露于一系列浓度的CPZ（0、10、20、30、40、50、80、160和320 μM），在非胆汁淤积或胆汁淤积条件下（存在或不存在胆汁酸混合物（BA 40×或80×））持续24和72小时。使用AlamarBlue试剂测定细胞活力（B），通过LDH测定法评估细胞毒性（C）。

氯丙嗪和胆汁淤积会影响胆汁转运体的表达水平

本研究探讨了氯丙嗪（CPZ）和胆汁淤积对胆管上皮细胞类器官中胆汁转运体表达水平的影响。胆管上皮细胞在胆汁酸转运中起关键作用，转运体表达的改变会影响胆汁流动和稳态。

研究发现，在胆汁淤积和非胆汁淤积条件下，CPZ暴露导致参与胆汁酸转运的多种转运体表达水平发生变化。例如，CPZ暴露在不同条件下对顶膜转运体如ATP结合盒式蛋白C亚家族成员2（ABCC2）和溶质载体家族10成员2（SLC10A2）的mRNA水平有不同影响。CPZ暴露还影响了外排转运体如ABCB1和SLC51A的表达，胆汁淤积条件加剧了这些影响。此外，CPZ暴露还影响了ABCC3和SLC51B的表达水平，与24小时相比，72小时后的影响更为显著。

这些结果表明，CPZ和胆汁淤积可以调节胆管上皮细胞类器官中胆汁转运体的表达，可能破坏胆汁酸转运并导致胆管损伤。

图2 氯丙嗪（CPZ）和胆汁酸混合物对转运体的影响。A、B 胆管上皮细胞类器官（CLCOs）在有无胆汁酸混合物（BA 40×或80×）的情况下，用30 μM氯丙嗪预处理24小时（A）和72小时（B）。通过实时定量PCR（qPCR）测定CLCOs转运体的基因表达，并将其与管家基因进行标准化。

氯丙嗪诱导类器官的氧化应激反应

本研究探讨了氯丙嗪（CPZ）在胆管上皮细胞类器官（CLCOs）中诱导氧化应激的作用。氧化应激在胆汁淤积的早期阶段和进展中起关键作用，因此了解CPZ如何影响胆管上皮细胞的氧化应激对于阐明其毒性机制至关重要。

研究发现，CPZ处理在胆汁淤积和非胆汁淤积条件下均导致CLCOs中活性氧（ROS）产生增加，表明氧化应激的产生。CPZ暴露后，还原型谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比值降低，表明细胞抗氧化防御能力下降。此外，CPZ和胆汁酸暴露后总GSH水平（GSH + GSSG）也降低，进一步指示抗氧化剂的消耗。CPZ处理在胆汁淤积和非胆汁淤积条件下均上调了与氧化应激相关的基因，如谷胱甘肽S-转移酶ω1（GSTO1）、血红素加氧酶1（HO1）、转录因子NRF2和超氧化物歧化酶（SOD2）。

这些发现表明，CPZ在胆管上皮细胞类器官中诱导氧化应激，可能导致细胞损伤和胆管损伤。

图3 氯丙嗪（CPZ）和胆汁酸混合物对细胞内活性氧（ROS）生成和氧化应激相关基因表达的影响。A CLCOs中的H2DCFDA测定。CLCOs经30 μM CPZ预处理，有无胆汁酸混合物（BA 40×或80×），并以500 μM H2O2作为阳性对照处理2小时。B、C 在CLCOs中测定GSH/GSSG（B）和总GSH（GSH+2GSSG）（C）。CLCOs经不同条件（30 μM CPZ，有无胆汁酸混合物（BA 40×或80×））预处理24小时。D 氧化应激相关基因的表达。CLCOs经不同条件（30 μM CPZ，有无胆汁酸混合物（BA 40×或80×））预处理24小时。通过实时定量PCR（qPCR）测定基因表达，并将其与管家基因进行标准化。

氯丙嗪会破坏类器官的屏障功能

本研究探讨了氯丙嗪（CPZ）如何破坏胆管上皮细胞类器官（CLCOs）的屏障功能。胆管上皮细胞的完整性对于维持功能性屏障、保护肝脏组织免受胆汁中毒性物质的侵害至关重要。

研究发现，CPZ破坏了屏障功能，具体表现为：

1、CPZ导致紧密连接蛋白1（TJP1，也称为ZO1）和E-钙粘蛋白1（CDH1）的表达降低，这两种蛋白对于维持细胞间连接和屏障完整性至关重要。

2、涉及连接紧密性和细胞外基质形成的酶——赖氨酰氧化酶同源物2（LOXL2）在胆汁淤积和非胆汁淤积条件下均受到CPZ的下调。

3、ZO1和E-钙粘蛋白的免疫染色显示，CPZ处理后细胞间连接发生改变，且CPZ浓度越高，连接随时间降解越明显。

4、功能评估显示，CPZ处理导致罗丹明123从类器官管腔排出，表明屏障功能受损和运输过程障碍。

这些发现表明，CPZ通过影响胆管上皮细胞类器官的细胞间连接蛋白和改变运输过程来破坏屏障功能。

图4 氯丙嗪（CPZ）和胆汁酸混合物对屏障功能的影响。A 屏障功能相关基因的表达。胆管上皮细胞类器官（CLCOs）经30 μM CPZ预处理，有无胆汁酸混合物（BA 40×或80×），处理24小时。通过实时定量PCR（qPCR）测定基因表达，并将其与管家基因进行标准化。B、C 经CPZ暴露24小时（B）和72小时（C）后，通过免疫荧光法评估CLCOs的屏障破坏情况。比例尺=50 µm。

图5 跨上皮屏障功能。A 荧光图像通过管腔内荧光强度显示屏障功能。比例尺=1000µm。B CLCOs的管腔荧光强度均值，已标准化为背景水平。

促炎反应中的氯丙嗪和 TNFα

本研究探讨了氯丙嗪（CPZ）和肿瘤坏死因子α（TNFα）在胆管上皮细胞类器官（CLCOs）中诱导的促炎反应。先天性免疫反应和炎症在药物性肝损伤，包括胆管损伤中，起着关键作用。

研究发现CPZ和TNFα在类器官中引发的促炎反应的关键内容包括：

1、CPZ处理导致促炎细胞因子相关基因表达发生变化，包括前列腺素内过氧化物合酶2（PGTS2）、集落刺激因子2（CSF2）和各种趋化因子的上调。

2、与单独使用TNFα相比，CPZ和TNFα联合处理导致炎症标志物上调，表明两者在炎症方面具有协同作用。

3、使用乳酸脱氢酶（LDH）测定法进行的细胞毒性评估显示，与单独治疗相比，CPZ和TNFα联合处理组的细胞损伤增加，这表明炎症可能加剧药物诱导的胆管损伤。

这些发现强调了CPZ暴露、TNFα信号和胆管上皮细胞类器官中促炎反应之间的相互作用，突显了炎症在药物性胆管损伤中的重要性。

图6 氯丙嗪（CPZ）和肿瘤坏死因子α（TNFα）在促炎反应中的作用。A 促炎细胞因子相关基因的表达。胆管上皮细胞类器官（CLCOs）经30 μM CPZ和/或30 ng/mL TNFα预处理24小时。通过实时定量PCR（qPCR）测定基因表达，并将其与管家基因进行标准化。B CPZ-TNFα的细胞毒性。CLCOs经30 μM CPZ和/或30 ng/mL TNFα预处理24小时。通过乳酸脱氢酶（LDH）测定法测定细胞毒性。

总结

这篇文章通过使用胆管细胞样细胞团（CLCOs）模型，研究了氯丙嗪（CPZ）对胆管细胞的影响，重点关注了氯丙嗪在诱导氧化应激、破坏屏障功能和促进炎症反应方面的作用。研究发现，氯丙嗪暴露导致CLCOs中氧化应激的增加，表现为活性氧物质的生成和抗氧化防御物质的耗竭。此外，氯丙嗪还破坏了细胞间连接蛋白，影响了细胞间连接和屏障功能，进而导致传输过程的受损。另外，氯丙嗪与TNFα联合处理引起了炎症标志物的上调，显示了炎症在促进药物诱导的胆管损伤中的重要作用。这些发现有助于深入了解氯丙嗪对胆管细胞的毒性机制，为预防和治疗药物诱导的肝损伤提供了重要参考。

参考信息

Cholangiocyte organoids to study drug-induced injury.Stem Cell Res Ther. 2024 Mar 13;15(1):78. doi: 10.1186/s13287-024-03692-6.PMID: 38475870 PMCID: PMC10935784.

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