胆汁酸相互作用蛋白

一、 简介

胆汁酸（BAs）是一类以甾体为母核侧链的、含有羟基的重要内源代谢物[1]。不仅仅作为人体内胆固醇代谢的终产物，胆汁酸以信号分子的身份在信号传导、代谢调控等方面发挥着重要的功能。本文将介绍人体中经典的胆汁酸相互作用蛋白及其功能，并对新型胆汁酸受体的发现策略及当前进展进行总结。

二、 胆汁酸介绍

胆汁酸（BAs）是一类分子的总称，其中包含由肝脏细胞合成的初级胆酸和由肠道共生菌进一步代谢产生的次级胆酸。初级胆酸的合成由胆固醇起始，在经典途径中胆固醇首先在7α羟化酶（CYP7A1）的催化下生成7α羟基胆固醇，而后在进一步的催化作用下生成胆酸（CA）和鹅去氧胆酸（CDCA）。初级胆酸会进一步地缀合甘氨酸或牛磺酸生成胆盐储存在胆囊中。此外，在啮齿类动物和熊体内，CDCA还会分别被进一步转化为鼠胆酸（MCA）和 去氧胆酸（UDCA）[2]。

在进食时，BAs会被释放到肠道中以辅助对于食物中营养物质的吸收，并在肠道菌群的作用下进一步地被代谢为次级胆酸。肠道菌群的代谢进一步提升了胆酸池的多样性，它们首先会通过胆盐水解酶（BSH）的作用将胆盐重新转化为CA和CDCA，而后进一步通过脱羟基化作用合成去氧胆酸（DCA）和石胆酸（LCA）。在近些年的研究中，这一脱羟基化过程被证明主要是由Clostridium scindens中bai基因编码的一系列酶所介导的[3]。在到达回肠末端之前，大约有95%的胆汁酸都会通过肝肠循环被重吸收，仅有少量会随粪便排出体外。

图1：胆汁酸的化学结构及人体内胆汁酸的肝肠循环[4]

三、 经典胆汁酸相互作用蛋白

在人体中，目前主要的胆汁酸受体主要包含核受体和G蛋白偶联受体（GPCR）两类。其中，核受体主要包括法尼醇X受体（FXR）、孕烷X受体（PXR）、维生素D受体（VDR），主要参与脂质与葡萄糖稳态、能量代谢、胆汁酸本身的合成方面的调控[5]。GPCR类受体则主要包括G蛋白偶联胆汁酸受体1（GPBAR1或TGR5）、鞘氨醇-1-磷酸受体（S1PR2）和毒蕈碱型乙酰胆碱受体（CHRM2/3），参与抗炎及免疫调节[6, 7]。

• FXR调控胆汁酸的合成与转运

FXR是首个被发现的胆汁酸受体，其可以被游离型和结合型胆酸所激活[8]。激活后的FXR通常会通过两种方式调控下游基因的表达：①与维甲酸X受体（RXR）形成异源二聚体促进目标基因的表达；②上调转录抑制子小异二聚体伴侣（SHP），SHP竞争性地与其他核受体结合从而抑制基因的表达。

在肠道细胞中，BAs激活成纤维细胞生长因子 15 (FGF15)/FGF19，该因子会进入肝脏，通过 FGF 受体 (FGFR) 抑制 BAs代谢。BAs也可以直接激活肝脏中的FXR，促进SHP表达。而这两条信号通路也均能抑制CYP7A1和CYP8B1的表达，从而抑制BAs的合成[9]。此外，为降低BAs对细胞的毒性，FXR一方面促进BA-CoA合成酶BAAT的表达，从而降低疏水性更强的游离胆酸含量[10]。另一方面，FXR也会通过促进微管胆盐外排泵（BSEP）的表达以及抑制BAs转运蛋白，如有机阴离子转运肽1（OATP1），来降低BAs在细胞中的积累[11]。

与FXR相似，PXR和VDR也在BAs的转运与清除中发挥着重要的作用。PXR和VDR被激活后会通过促进CYP3A和磺基转移酶（SULTs）的表达，使疏水性最强的胆汁酸LCA氧化或者形成磺酸盐[12, 13]。此外，二者也会通过促进LCA外排蛋白OATP2和多药耐药蛋白3（MRP3）的表达，起到减毒的作用[14, 15]。

图2：胆汁酸的信号传导[16]

• TGR5参与能量及免疫调节

TGR5是首个被鉴定为能被BAs激活的GPCR[7]，其广泛存在于棕色脂肪细胞、巨噬细胞、单核细胞、脾脏细胞、胆囊上皮细胞和肠道中，且发挥着不同的功能，尤其在结肠中有较高的表达水平[8]。在肠道巨噬细胞中，TGR5被激活后影响TNFα和NF-κB通路，抑制促炎细胞因子的释放，从而发挥抗炎的作用[17]。在棕色脂肪细胞中， TGR5 通过诱导 2 型碘甲状腺氨酸-脱碘酶的表达来刺激能量消耗，从而将无活性的甲状腺素转化为 3,5,3'-三碘甲状腺氨酸，从而激活甲状腺激素受体，激活线粒体功能并增加产热，以及激活线粒体生物发生的调节剂[18]。

受体

配体激活效力

FXR

CDCA＞LCA=DCA＞CA

PXR

3-keto-LCA＞LCA＞DCA=CA

VDR

LCA＞DCA＞CA

TGR5

LCA≥DCA＞CDCA＞CA

表1：不同胆汁酸对受体的激活能力

四、 化学探针在胆汁酸相互作用蛋白发现中的应用

尽管关于胆汁酸的受体及其所介导的信号通路方面的研究已经取得了一系列重要的进展，但这些研究仍然主要集中在FXR和TGR5这两个最早被发现的BAs受体上。因此，新型的胆汁酸受体亟待被发现和研究。化学小分子探针的开发对于这些BAs相互作用蛋白的鉴定及研究发挥着重要的作用。近些年来，研究者在胆汁酸分子结构基础上进行衍生，发展了一系列探针，并联合化学蛋白组学技术实现了新型胆汁酸受体的发现与研究。

• BAs探针的设计

基于此前的研究，BAs与受体蛋白的相互作用一般是非共价的。因此，为实现小分子与蛋白的稳定结合，可以在不影响其本身活性的基础上，在其结构上引入光交联基团。目前，常见的光交联基团包括二苯甲酮、双吖丙啶等[19]。以双吖丙啶为例，在UV365nm波长的照射下，该基团会产生卡宾自由基并随机地插入到邻近的氨基酸残基中，从而将小分子探针和与之邻近的蛋白稳定连接。实现稳定连接后，BAs探针同时需要一个可富集基团用于对靶蛋白的鉴定。而一价铜离子催化的炔基-叠氮环加成反应（CuAAC or Click Chemistry）[20]则因反应条件温和、生物相容性好等优势，广泛地被引入到探针的设计中。

图3：常见光交联基团及探针设计[19]

• 宿主细胞中BAs相互作用蛋白的发现

受到Hulce等所开发的胆固醇光交联探针启发[21]，Zhuang等在人体内含量最高的初级胆酸CA的结构基础上发展了一系列的光交联探针。作者在CA分子结构的不同位置进行改造，，作者发现P2交联到681个靶蛋白，在三种探针中数目最多，且能够鉴定到FXR、EPHX1等已知的CA受体。详细内容见【号外 | 王初课题组利用光交联探针大规模鉴定胆酸相互作用蛋白】。

• 肠道共生菌中BAs相互作用蛋白的发现

人体内的肠道共生菌也长期处于胆汁酸的环境中。为探究细菌如何耐受高浓度的胆汁酸，Liu等进一步采用CA光交联探针探究了CA在大肠杆菌（Escherichia coli，strain K12）中的相互作用蛋白[23]。采用定量化学蛋白质组学技术，作者在细菌裂解液中鉴定到587个置信度较高的CA相互作用蛋白，并通过生物信息学分析发现这些蛋白主要集中在具有自磷酸化功能的双组份系统（Two-component Systems，TCS）中。在进一步研究中，作者发现细菌内膜蛋白EnvZ作为一个新型的CA受体在细菌感受胆酸压力中起到重要的作用。当CA与EnvZ的周质区结合后，会促进下游反应调节子OmpR的磷酸化，最终促进外膜孔道蛋白OmpC的表达，从而加速CA外排，以实现对于胆汁酸的耐受。详细内容见【号外 |王初课题组与雷晓光课题组合作发展化学蛋白质组学策略揭示细菌耐受胆汁酸的机制】。

图4：EnvZ作为CA受体促进胆汁酸耐受

• 病原菌中的BAs相互作用蛋白发现

为探究胆汁酸抵抗病原菌入侵的分子机制。美国Scripps研究所的Howard C. Hang教授及合作者针对CDCA以及次级胆汁酸LCA发展了光交联探针并评价了这些探针的生物学活性。在沙门氏菌入侵宿主细胞的体系中，Yang等[24]发现与其他几种常见的胆汁酸相比，只有CDCA表现出显著的抵抗沙门入侵HT-29细胞的能力，且在其C3位衍生光交联基团和用于富集的炔基基团不影响其抗菌活性。因此他们采用alk-X-CDCA探针用于沙门中的CDCA相互作用蛋白发现并以UDCA和LCA探针作为对照，采用化学蛋白质组学策略鉴定那些被CDCA探针特异性富集到的靶点。最终，他们发现CDCA可以通过与毒力相关蛋白HilD的Jelly-roll结构域结合、干扰其二聚从而发挥降低细菌毒力的功能。详细内容见【Nat. Chem. Biol.｜胆酸可结合沙门氏菌毒性调节因子并发挥抗感染效果】。

图5：CDCA抑制沙门氏菌中的毒力调节因子

此外，为探究LCA在抵抗艰难梭菌感染（C. difficile infections，CDI）中的作用，Forster等[25]采用alk-X-LCA鉴定了艰难梭菌中的石胆酸互作蛋白。该探针在C3-OH基础上通过醚键衍生炔基，并在C7位衍生双吖丙啶基团。通过评价探针对艰难梭菌的抑菌活性，作者发现alk-X-LCA具有比天然LCA更好的抑菌效果。通过组学研究，作者发现LCA可以与转录调节因子BapR相互作用并促进甲硫氨酸γ裂解酶MdeA以及两种推定的转运体的表达，从而促进艰难梭菌的代谢适应。

图6：LCA结合艰难梭菌中的转录调节因子

五、 总结

胆汁酸受体的发现加深了人们对胆汁酸信号传导的认识，同时也推动了新型疾病疗法的开发。针对当前研究较为深入的胆汁酸受体FXR和TGR5，研究人员开发了相应的激动剂和拮抗剂并用于了胆汁淤积、非酒精性脂肪肝（NAFLD）、非酒精性脂肪肝炎（NASH）及糖尿病等疾病的治疗。近些年来，化学蛋白组学技术的发展推动了新型胆汁酸受体的发现，且随着人们对肠道菌群研究的不断深入，肠道共生菌及病原菌中的胆汁酸受体也得到了广泛的关注和研究，而这些研究将为肝脏及肠道疾病的治疗提供新的思路。