《食品科学》：大连民族大学阮成江教授等：基于UPLC-MS技术分析沙棘果肉成熟过程中生物活性成分差异

沙棘（Hippophae L.）属胡颓子科沙棘属植物，是水土保持和生态建设的重要经济树种。沙棘果实、叶和茎中富含多种对人体有益、具较高营养和药用价值的生物活性成分，在食品、日化和医药等行业被广泛应用。发育期间的沙棘果肉从绿色经黄绿色，逐渐转变为黄色、橙黄色或橘红色，黄酮类化合物、VC、类胡萝卜素、5-羟色胺、γ-氨基丁酸、脂肪酸、多糖和有机酸等代谢物含量发生显著变化。

为解析沙棘油脂、黄酮等生物活性成分的合成代谢规律，大连民族大学资源植物研究所丁健、阮成江*和西藏农牧学院资源与环境学院杨红等以2 个沙棘品系发育期间（绿色和橙色时期）的果肉为研究对象，采用超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）技术对沙棘果肉生物活性成分进行全面解析，从非靶向代谢组学角度阐明沙棘果肉发育期间的差异代谢轮廓，筛选与沙棘果肉生物活性成分合成相关的关键代谢物，为揭示木本沙棘果肉中抗癌生物活性成分合成积累机理提供科学依据。

01

不同沙棘果肉样品的PCA

基于XCMS，在沙棘品系‘Za56’和‘TF2-36’发育期间的果肉样品（56G、56O、36G和36O）中共检测到3 385 个（ESI正离子模式）和2 837 个（ESI负离子模式）代谢特征离子信号。利用SIMCA软件构建无监督PCA模型，4 组样品的数据点在PCA得分图上区分明显（图1），在两两比较PCA得分图中也显著区分（图2），所有样本均落在95%置信区间内，说明代谢组组间的分析数据可信度较高。

02

不同沙棘果肉样品的OPLS-DA

为获得4 组样品间的差异信息，建立有监督OPLS-DA模型。沙棘品系‘Za56’和‘TF2-36’的绿色和橙色果实样品点分布在不同区域并且明显分为不同簇（图3），表明4 组样品在代谢物种类、含量上存在差异。经7 次循环交互验证发现RY2、Q2＞0.9（越接近1表明模型越稳定可靠）（表1）；然后，经200 次循环迭代置换验证发现Q2intercept ＜0（负值表明未发生过拟合），因此，建立的OPLS-DA模型稳定可靠，具有较高的预测能力。

03

差异代谢物的筛选与识别

根据OPLS-DA获得的VIP＞1和t检验的P＜0.05筛选组间的显著差异代谢物。在56G vs. 56O、36G vs. 36O、56G vs. 36G和56O vs. 36O比较组中，分别有72、70、83 个和64 个显著差异代谢物（包括正、负离子模式），在各比较组中，呈下调趋势的差异代谢物较多（图4）。由于同一代谢物可在不同组间均表现差异显著性，因此，共筛选到124 个显著差异代谢物，其中正离子模式下有73 个，负离子模式下有51 个。基于实验室自建数据库和HMDB数据库，识别到上述差异代谢物主要包括有机酸、碳水化合物、脂类、黄酮类、次生代谢物等（图5），其中，脂类和黄酮是被称为“软黄金”沙棘油中最有价值的生物活性成分，在代谢组层面解析了沙棘果肉生物活性成分的代谢特征，为进一步开展转录组、蛋白质组关联分析沙棘关键成分的合成机制提供科学依据。

04

与脂类合成代谢相关的显著差异代谢物分析

基于4 组果实样品（56G、56O、36G和36O）间的124 个显著差异代谢物数据，进一步利用HMDB数据库和KEGG代谢通路功能分析，共识别到15 个显著差异代谢物参与脂类、脂肪酸合成积累（表2），它们在4 组样品中呈现出不同的含量差异（离子峰的相对丰度），根据箱形图可直观反映各差异代谢物在4 组样品中的丰度变化（图6）。在‘Za56’和‘TF2-36’果肉发育过程中，分别识别到8 个和7 个显著差异代谢物，棕榈油酸、PC（16:0/16:0）、甘油磷酰胆碱、二羟基丙酮、植物鞘氨醇、二氢鞘氨醇和油酸呈上调趋势，尤其，PC（16:0/16:0）、二羟基丙酮和植物鞘氨醇在两个品系中均显著上调（表2）；另外，在两个品系的绿果和橙果时期分别发现9 个和10 个显著差异代谢物，PC（16:0/16:0）、甘油磷酰胆碱和二氢鞘氨醇呈上调趋势（图6），但只有甘油磷酰胆碱在两个比较组中均上调（表2）。

Omega-7脂肪酸通常在深海鱼类（如凤尾鱼、鲨鱼等）和少数植物种子（如澳洲坚果、猫爪草等）中积累，沙棘是自然界中罕有的在果肉（非种子组织）中高积累棕榈油酸（omega-7脂肪酸）的植物。 沙棘果肉棕榈油酸在‘Za56’发育期间显著上调，且在56O中显著高于36O（表2），这与‘Za56’果肉发育期间的C 16:1 含量显著上升，且‘Za56’发育期间的果肉含量（13.3%～41.30%）显著高于‘TF2-36’（12.57%～39.03%）的规律一致。

在‘Za56’和‘TF2-36’果实成熟过程中，橙色果实样品（56O和36O）的PC（16:0/16:0）显著高于绿色果实（56G和36G），而且在36G中显著高于56G（表2），表明成熟沙棘果肉的PC（16:0/16:0）相对含量较高，这与‘Za56’和‘TF2-36’果肉发育期间C 16:0 含量（分别升高1.5 倍和1.4 倍）和含油率（分别升高1.7 和3.7 倍）逐渐增加的规律相符，因此，PC（16:0/16:0）可能是影响沙棘果肉C 16:0 含量和含油率的代谢标志物。另外，LysoPC（16:0）和LysoPC（18:1(9Z)）的相对含量下调（表2），这可能与LPCAT优先以LysoPC（16:0）和LysoPC（18:1(9Z)）为底物而反应生成PC有关，而且，胆碱在各比较组中也呈显著下调趋势，即为DAG向PC转化提供了大量供体 。可见LysoPC（16:0）、LysoPC（18:1(9Z)）和胆碱的下调都与PC合成积累相关。除此之外，LysoPC还可被溶血磷脂酶I催化生成甘油磷酰胆碱，然后进一步被甘油磷酸二酯酶催化生成胆碱和甘油三磷酸（G3P） 。高油品系‘TF2-36’果肉中的甘油磷酰胆碱显著高于低油品系‘Za56’（ 表 2 ） ， 而 且 在 果 肉 发 育 期 间 呈 显 著 上 调 趋 势（图6），这与PC（16:0/16:0）的变化模式相似，这可能与甘油磷酰胆碱被催化为胆碱和G3P后，分别为PC和TAG合成提供更多前体物质有关。因此，甘油磷酰胆碱也可能是影响沙棘果肉含油率高低的代谢标志物。

05

与黄酮合成代谢相关的显著差异代谢物分析

在4 组果实样品（56G、56O、36G和36O）的代谢组比较中，共识别到7 个与黄酮合成相关的显著差异代谢物（表2），分别为异鼠李素、水仙碱/异鼠李素-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O芸香糖苷、儿茶素、柚皮素、芦丁和原花青素B 2 ，其中，只有异鼠李素在发育期间呈上调趋势。在沙棘果汁中异鼠李素含量最高（25.1～31.1 mg/100 g），其次为槲皮素（7.7～8.1 mg/100 g）和山柰酚（1.2～1.6 mg/100 g）；在沙棘全果实（含果肉和种子）中槲皮素（6.7～17.5 mg/100 g）和异鼠李素（4.5～10.6 mg/100 g）含量也较高。在‘Za56’和‘TF2-36’果肉发育期间分别识别到4 个和5 个显著差异代谢物，其中显著上调的仅有异鼠李素（表2），差异倍数（FC）分别达3.76和2.50，其他显著差异代谢物均不同程度的下调（图6），这与沙棘果汁中异鼠李素含量较高的规律相符。在56G vs. 36G和56O vs. 36O比较组中分别发现7 个和5 个显著差异代谢物，均显著上调（表2），即它们在‘TF2-36’果肉中的合成量一直高于‘Za56’（图6）。有研究发现沙棘总黄酮含量在果肉发育期间先下降后上升，而异鼠李素含量在沙棘果实发育期间呈显著上升趋势，这可能与儿茶素、山柰酚和芦丁含量显著下降有关。异鼠李素可能是影响沙棘果肉黄酮含量高低的代谢标志物。

06

5-羟色胺等生物活性成分分析

利用UPLC-MS技术在沙棘果肉中发现了5-羟色胺及其上下游代谢物，其中5-羟色胺及其前体色胺在各比较组中均呈下调趋势，而其代谢产物N-乙酰羟色氨在各比较组中均显著上调（表2），可见，二者之间的关键酶芳香基胺N-乙酰转移酶活性对5-羟色胺的合成积累具有重要影响 ，这可为解析沙棘5-羟色胺合成代谢机理提供科学依据，也为利用基因工程技术提高5-羟色胺含量提供了关键靶点。

本实验组在沙棘果肉中首次发现卡培他滨，有研究表明，它通过抑制细胞分裂、干扰RNA和蛋白质合成抑制肿瘤生长，是一种对癌细胞具有高选择性的口服抗癌药物。 在‘Za56’和‘TF2-36’果肉变色成熟期间，卡培他滨均显著上调（FC分别为1.32和2.63）（表2）。此外，在沙棘果肉中还发现了γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、白藜芦醇、甜菜碱、焦儿茶酚、VC和VB 6 等显著差异代谢物。尤其，‘TF2-36’成熟果肉（36O）中的GABA含量显著高于56O（FC=2.13）（表2），这与沙棘果肉的非靶向1 H核磁共振代谢组研究结果相 似。GABA是哺乳动物中枢神经系统中一种重要的抑制性神经递质，具有镇定、抗癌、降脂、降压等功能。发现并解析沙棘果肉的生物活性成分合成规律，为利用其为原料研发抗癌、抗抑郁，治疗心血管和精神类疾病等药物提供科学依据。

结论

采用UPLC-MS技术对2 个沙棘品系发育期间（绿色和橙色）的果肉进行了非靶向代谢组学研究。分析发现4 组样品间存在较大的代谢差异，并识别到124 个显著差异代谢物，包括有机酸、碳水化合物、脂类、黄酮类和次生代谢物等；根据KEGG代谢通路分析，分别识别到15、7 个和4 个显著差异代谢物与脂类、黄酮和5-羟色胺合成代谢相关，以及其他8 个与抗癌功能相关的显著差异代谢物。PC（16:0/16:0）和甘油磷酰胆碱在各比较组中均显著上调，它们是影响沙棘果肉含油率高低的代谢标志物。异鼠李素在各比较组中均显著上调，与沙棘果肉中富含黄酮密切相关。此外，

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本文《基于UPLC-MS技术分析沙棘果肉成熟过程中生物活性成分差异 》来源于《食品科学》2023年44卷第22期276-286页，作者：丁健, 阮成江, 杨红, 等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220904-038。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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