脑声常谈丨啮齿动物急性疼痛模型分类制备与行为学检测方法

疼痛对啮齿动物的行为具有显著影响，基础研究中常用的动物模型是雄性大鼠。大鼠体型适中，行为训练期短，易操作、模拟损伤是其优势，小鼠饲养成本低、品系丰富。近年来，受转基因小鼠、化学遗传等因素影响，小鼠的应用也越来越多。狗等哺乳动物存在使用和饲养成本高等问题而极少使用。研究发现，不足10%的小鼠研究使用远交系小鼠；而大鼠研究中，超过80%均使用远交系。应用较多的C57BL/6近交系小鼠表现出对热刺激的高敏感性及对损伤引起的超敏反应的快速恢复性。在慢性疼痛的相关研究中，选择远交系小鼠或许能更好地模拟患者的慢性疼痛，具有“广泛性表型”的特征。慢性疼痛与复杂的生活史息息相关，应考虑这些因素对啮齿动物模型产生的影响，使用更具有异质性的动物模型。目前，大部分研究中的建模动物选择2～3月龄的大、小鼠，较适宜于急性疼痛的研究。综上，疼痛研究中选用远交系大/小鼠更具针对性，且应纳入月龄较大且不同性别的动物。

急性疼痛模型

根据疼痛的发生原理，急性疼痛可分为生理性和病理性。生理性疼痛是指增加的局部刺激使机体产生的反应性疼痛；病理性疼痛是由创伤或疾病状态带来的炎症反应或神经损伤引起的，若迁延不愈可发展为慢性疼痛。

目前更常见的分类方法是根据所模拟疾病的病理生理特点，将急性疼痛模型分为躯体痛模型和内脏痛模型两类。研究认为，躯体痛可通过福尔马林模型进行模拟。

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躯体痛模型

将1%的福尔马林液注射至实验鼠右后爪背侧，其可出现两个不同时相的疼痛反应。第一时相为注射后立刻出现的疼痛，持续时间约为10min；第二时相则从注射15～20min后开始，持续时间约为1h。在实验研究中，常使用第二时相。两时相疼痛的发生机制不同，如非甾体类镇痛药可减轻第二时相疼痛，但无法控制第一时相疼痛。大鼠和小鼠对福尔马林注射的反应也有所不同：大鼠表现为爪趾抽缩，小鼠表现为舔舐。目前认为第二时相疼痛是周围炎症性疼痛，与中枢敏化作用相关，该模型可用于因组织损伤造成的痛觉过敏机制的探索。

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内脏痛模型

内脏痛动物模型主要通过炎性刺激触发并建立。例如，扭体试验是将刺激性化学物质注入实验动物体腔内，从而引发炎性疼痛。将乙酸、缓激肽等试剂注入动物腹腔，观察动物随之表现出的臀部位置不正、腹部收缩等扭体反应，动物体位的改变幅度或收缩动作频率数据可用于量化评估。该方法可制备相应急性膀胱炎模型、溃疡性结肠炎模型等。小鼠醋酸扭体实验小鼠70只，雌雄各半，随机分组，实验前禁食12h，自由饮水。给药后40min，小鼠腹腔注射0.6%的醋酸溶液，记录15min内的扭体次数，以小鼠出现腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高起等行为为扭体反应阳性。计算各组疼痛抑制率，公式为：疼痛抑制率(%)=生理盐水平均扭体数−给药平均扭体数生理盐水平均扭体数×100%。

福尔马林也可用于经典急性内脏痛模型的构建，向大鼠结肠壁注射1.5%的福尔马林，15min后大鼠会出现舔舐、身体收缩、扭头等动作，从而证实建模成功。大鼠福尔马林刺激实验受试大鼠进行“疼痛反应累积分值”预筛实验，试验时，在大鼠左后肢足趾部皮下注射2.5%的福尔马林溶液50μl后，分别观察1～10min（Ⅰ相）和10～40min（Ⅱ相）内大鼠的疼痛反应。表现为舔、咬、抖足为3分，提足为2分，轻触地面但不负重行走时跛行为1分，正常负重，行走自如为0分。记录各时间段出现上述各级反应的秒数乘以相应反应的分值，以乘积之和为疼痛反应累积分值，公式为：疼痛反应累积分值＝跛行时间×1+提足时间×2+舔咬抖足时间×3。给药后后，在大鼠右后肢足趾部皮下注射2.5%的福尔马林溶液50μl，再次观察I相和II相疼痛反应，并计算各组的疼痛反应累积分值和疼痛抑制率。疼痛抑制率计算公式为：疼痛抑制率(%)=生理盐水组疼痛反应均值−给药组疼痛反应均值生理盐水组疼痛反应均值×100%。

疼痛行为学检测

疼痛行为学检测疼痛行为学检测是对实验动物施加急性、伤害性刺激，通过动物缩足或甩尾潜伏期、机械性刺激或温度刺激阈值等反射行为学变化，评估动物是否出现触诱发痛、机械性痛敏及冷热刺激反应。该类操作模拟生理性急性疼痛，无法使实验动物产生病理改变，因此不能单独用于模型制作，但常被用于各类疼痛动物模型中痛阈变化的验证。

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VonFrey试验

机械性痛觉反应检测通常采用VonFrey试验，利用VonFrey纤维丝弯曲产生既定压力，按压力的小大顺序刺激实验动物脚底并记录其机械缩足阈值；或以恒定压力的VonFrey纤维丝以恒定的频率反复刺激，测试实验动物后腿收缩频率，即机械缩足持续时间。目前，该方法已逐渐被更加便捷、精准的VonFrey电子仪所取代，以保证纤维丝连续、均匀施力。

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模拟内脏痛

经大鼠肛门插入可扩张的气囊，通过注气扩张结直肠可模拟内脏痛，评估动物的诱发痛行为。痛阈可通过腹壁撤回反射评分进行评价。该实验评估标准为大鼠的行为模式改变程度，实验结果主观性较强。

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甩尾实验

甩尾实验是基于实验鼠对热刺激回避反应的潜伏期进行测量的实验。其操作方式为对实验鼠尾部施加热刺激，记录实验鼠尾巴甩动时间。小鼠甩尾实验受试动物均进行“基础痛阈”预筛实验，实验时，将小鼠尾下部垂直浸入（52±0.5）℃的恒温水浴中，浸入长度为3cm左右，以尾回缩出水面的潜伏期为测痛指标，给药前间隔5min测定2次，以其均值作为基础痛阈。选择基础痛阈相近（3～7s）的动物作为合格动物进行实验。筛选后动物恢复24h，重新分组进行正式实验。给药后进行痛阈测定，间隔5min测定2次，以其均值作为给药后痛阈。为防止尾部烫伤，若痛阈超过14s则停止水浴，以14s计算。

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热板测痛

相比于甩尾实验，冷热刺激反应是啮齿类动物疼痛评估的常用方法。热板实验的优点在于不用约束实验鼠，从而减少因人为干扰可能形成应激导致的疼痛。哈格里夫斯试验通过小鼠后爪移开某一热刺激所需的时间评估研究对象的疼痛反应。将甩尾实验中的远端热水浴替换为冰水混合物即可用于检测冷阈值，即冷刺激反应。小鼠热板实验受试小鼠为雌性，均进行“基础痛阈”预筛实验，实验时，将小鼠放在预热至（55±0.5）℃金属板上，恒温，以小鼠舔足反应或跳跃反应的潜伏期为痛阈指标。每只动物测定间隔5min，测定2次，取其平均值作为基础痛阈值。选择基础痛阈相近（5～20s）的小鼠进行正式试验。筛选后小鼠恢复24h以上，重新分组进行正式实验。给药后，进行痛阈测定。间隔5min测定2次，以其均值作为给药后痛阈值。为防止足部烫伤，若痛阈值超过40s则停止测定，以40s计算。

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丙酮实验

丙酮实验通过将丙酮滴到实验大鼠后肢局部造成冷刺激，这种刺激不会让正常大鼠感到疼痛，但存在冷触觉过敏大鼠则会有疼痛反应。因正常小鼠对丙酮相当敏感，易产生疼痛反应，故小鼠不适合丙酮实验；丙酮滴导致的抬足反应可能是由于冷刺激，也可能是由于化学刺激，甚至是丙酮滴的机械刺激。

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冷板实验

目前，冷平板实验多使用半导体制冷平板，适用于冷刺激痛及冷痛觉过敏的神经生物学机制和药物疗效研究。相较于丙酮实验，冷平板实验受环境温度和实验动物体温影响较小，但无法避免机械刺激的影响是其劣势。上述经典检测方式的局限性在于所检测到的反应仅为健康实验动物接受急性伤害性刺激后的变化，且因重复测试，动物可能会学习到行为反应，从而导致实验数据不够准确。

文献引用

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