《食品科学》：大连工业大学姜淑娟副教授等：微生物发酵法制备乳源生物活性肽研究进展

生物活性肽是由短氨基酸序列组成的特异性蛋白质片段，存在于各种富含蛋白质的食物中，具有广泛的生物功能，包括抗菌、抑制血管紧张素转化酶（ACE）等，由于它们具有特异性高、毒性低、结构多样性高和分子质量低等特点，被认为是应用于保健品或功能性食品的理想物质。乳源生物活性肽具有活性强、易制备、安全性高等优点，在发酵乳制品中的生理功能也在不断被发现。

生物活性肽在食品蛋白中的释放主要是通过酶解法、微生物发酵法和化学法，这些方法主要是通过酶、微生物和化学试剂等作用来分解蛋白质，进而释放功能肽。大连工业大学食品学院的李思怡、姜雨彤、姜淑娟*等人对近年来通过微生物发酵法制备乳源生物活性肽的研究进展进行了综述，并对乳蛋白发酵降解产生的活性肽的生理功能进行归纳总结，以期为发酵法制备乳源生物活性肽的研究提供参考。

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微生物发酵法制备乳源生物活性肽概述

近年来带有生物活性标签的发酵食品越来越受到消费者的青睐。释放以非活性形式存在于乳蛋白中的生物活性肽主要通过以下3种方式：1）利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等消化酶酶解；2）用蛋白水解起始培养物进行发酵；3）由源自蛋白水解微生物的酶进行蛋白水解。微生物发酵法是利用微生物发酵过程中产生的复合酶系将大分子蛋白分解为小分子蛋白，在微生物的作用下肽基团发生修饰和重组进而获得生物活性肽的一种生物技术。在这种肽的制备方法中，通常使用的微生物是具有高蛋白酶活性和多种肽酶的乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌和霉菌，它们可以存在于基质中或作为添加的起始培养物。然而，由于每种微生物蛋白水解系统的独特性，它们发酵的最终结果也是不同的。

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乳酸菌发酵法制备乳源生物活性肽

乳酸菌因其具有高效的蛋白水解系统以及对不同环境和底物的高度适应性，被认为是获得生物活性肽最有价值的微生物之一。乳酸菌的蛋白水解系统由细胞壁蛋白酶和许多不同的细胞内肽酶组成，包括内肽酶、氨基肽酶、二肽酶和三肽酶，通过该系统水解产生的肽表现出抗菌、抗炎、ACE抑 制、免疫调节等各种生物活性。目前，国内通过益生菌发酵产生生物活性肽方面的研究起步较晚，因此通过乳酸菌发酵法制备乳源生物活性肽是很有意义的探索。

2.1 乳酸菌发酵法制备牛乳源活性肽

干酪乳杆菌作为一种很有前景的功能性菌株，能够提升乳制品对人的健康益处。乳酸乳球菌可以取代商业发酵剂用于生产发酵乳制品，是最重要的乳酸菌之一。Rodriguez-Figueroa等通过体内实验研究了乳酸乳球菌发酵乳对自发性高血压大鼠的降血压和降血脂作用，结果表明，连续食用由乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NRRL B-50571和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NRRL B-50572发酵的牛乳可以降低自发性高血压大鼠的收缩压和舒张压，饮用乳酸菌发酵牛乳3 周后，自发性高血压大鼠的收缩压和舒张压分别降低了23.3 mmHg和49.8 mmHg，同时乳酸菌发酵乳也可以降低自发性高血压大鼠血浆低密度脂蛋白、胆固醇和甘油三酯的含量，这些结果表明，由乳酸菌发酵的牛乳可能是降低高血压和高脂血症的辅助剂，也可以用作功能性食品改善心血管健康。

2.2 乳酸菌发酵法制备羊乳源活性肽

羊乳有多种健康益处，在消化性、酸碱性和缓冲能力方面与牛乳不同，同时羊乳也因其对过敏人群的治疗作用而倍受欢迎。但我国目前对于羊乳资源的开发利用主要停留在乳粉和液态乳开发层面。

曹吉利等以2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）自由基清除率作为检测指标筛选能够在发酵羊乳后高产抗氧化肽的乳杆菌菌株，结果表明，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）L60发酵后的羊乳DPPH自由基清除率达到了69.14%，具有较高的产抗氧化肽能力。同时，植物乳杆菌也是具有抗高血压活性的潜在菌株，Chen Li等从内蒙古发酵牛乳中分离得到了具有高ACE抑制活性的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）69，使用植物乳杆菌69发酵的羊乳ACE抑制活性达到88.91%，显示出了较高的抗高血压能力。除了植物乳杆菌外，经发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）KGL4发酵后的羊乳抗氧化和抗菌活性随着发酵时间的延长而增强，同时发酵羊乳显著降低了脂多糖（LPS）刺激的RAW 264.7细胞中过多的肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素1β（IL-1β）的产生，显示出明显的抗炎活性。并且使用具有良好蛋白水解活性的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）NK9和发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）LF发酵的羊乳也表现出一定的ACE抑制活性，利用这两种潜在的乳杆菌培养物发酵羊乳可能成为ACE抑制肽的新来源。

2.3 乳酸菌发酵法制备骆驼乳源活性肽

骆驼乳在营养成分方面更接近人乳，蛋白质构成比例合理，具有多种生物活性物质，不含有致敏性的β-乳球蛋白，可作为牛乳过敏人群的替代乳。

骆驼乳蛋白质中酪蛋白占总蛋白质含量的61.8%～88.5%，其中β-酪蛋白含量远高于牛乳，同时酪蛋白也是骆驼乳中生产生物活性肽的主要来源。与发酵牛乳相比，发酵骆驼乳对健康的促进作用更高。驼乳抗氧化肽的制备主要采用酶解的方式，但近年来一些研究则利用发酵菌株以提高其蛋白水解产物的抗氧化活性，其中乳酸菌发酵对骆驼乳的抗氧化活性和ACE抑制活性有很大影响。

目前，对乳源抗菌肽的研究主要集中于牛乳和羊乳，有关驼乳抗菌肽的研究较少。驼乳含有重要的抗菌成分，如免疫球蛋白、乳铁蛋白和溶菌酶等保护性蛋白，近年来学者们又对这些蛋白进行水解，研究了水解后抗菌活性的变化。Algboory等的研究表明用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）IS10发酵骆驼乳24 h后得到了7 种新型多肽，这些肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌亚种显示出较强的抗菌活性。

表1总结了近5 年乳酸菌发酵乳制品的生物活性肽产生情况。

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芽孢杆菌发酵法制备乳源生物活性肽

芽孢杆菌由于其发酵周期短、生长速率高和高产蛋白酶的特性，被认为是工业发酵中生产用于食品商业蛋白酶的主要细菌。其中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等的“GRAS”特性，使其在工业生产中更具吸引力。枯草芽孢杆菌可以有效水解乳蛋白，利用枯草芽孢杆菌发酵法生产乳蛋白肽有着较好的应用前景。此外，蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、霉菌芽孢杆菌等菌株均能有效水解酪蛋白，其中蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）发酵酪蛋白后产生了两种新型抗菌肽（IKHQGLPQE和VLNENLR），抗菌实验结果表明，该肽对婴儿配方奶粉中的病原体阪崎肠杆菌（Cronobacter sakazakii）具有显著的抑制活性。

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酵母菌发酵法制备乳源生物活性肽

酵母菌在乳品（Kefir、酸马奶、酸驼奶等）中发挥着重要作用，它们不仅可以代谢多种牛奶成分，赋予发酵乳独特的风味特征，同时还能水解乳蛋白产生生物活性肽。酵母菌如马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母菌具有一组负责降解蛋白质的蛋白酶和肽酶，它们主要用于在乳制品中分解乳蛋白并获得生长所需的肽和氨基酸。Bintsis等的研究表明，一些酵母菌具有比乳酸菌更高的蛋白水解活性；Klein等在研究中发现，酵母菌表现出强大的肽酶活性，在降解β-酪蛋白衍生肽方面比瑞士乳杆菌更有效。

工业中常使用富含益生菌微生物的发酵剂，以获得与传统方法制备的发酵乳相同的化学和功能特性，酵母菌益生作用以及分泌细胞外生物活性代谢物（如肽等）的能力可以增加发酵乳的功能。另外，酵母菌的羧肽酶和氨基肽酶在牛奶蛋白水解中也起着重要作用，这可能会产生新的生物活性肽。

此外，酵母菌的高蛋白水解活性可产生芳香前体，从而形成许多芳香化合物，进而直接影响发酵乳制品的风味或充当风味前体。

表2总结了近10 年酵母菌发酵乳制品的生物活性肽产生情况。

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霉菌发酵法制备乳源生物活性肽

一些真菌如埃及曲霉和米曲霉在制备生物活性肽方面具有重要应用，这些真菌虽没有像乳酸菌那样的蛋白水解系统，但它们含有各种蛋白酶，通过肽键的断裂参与蛋白质的水解，进而获得生物活性肽。

霉菌中的米曲霉能产生多种蛋白酶，包括酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶，且蛋白酶专一性不强，在蛋白酶系的作用下，米曲霉可以将植物或动物源的多种蛋白质降解为蛋白胨、肽和氨基酸。

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乳源生物活性肽制备方法优、缺点比较分析

酶解法、微生物发酵法和化学法是生物活性肽在食品蛋白中释放的主要方法，其中化学水解的方法因其非特异性、产率低、会导致氨基酸变性等缺陷而不是获得生物活性肽的合适方法。另外也可以利用重组DNA技术通过微生物来制备生物活性肽，但这一技术的局限性在于转基因生物在食品中的应用以及生产出的多肽可能对宿主机体产生有害影响。

6.1 酶解法

在乳制品加工过程中，蛋白酶特定的活性位点首先与底物结合，然后通过氢键、范德华力或疏水相互作用形成酶-底物复合物，最后当酶-底物复合物处于特定构象时，它可以将大的蛋白质片段水解成较小的肽或单个氨基酸。表3包含了在乳制品加工过程中使用的来源于动物、植物和微生物的外源性蛋白酶，使用各种蛋白酶对乳蛋白进行酶水解产生的一系列水解产物可作为生物功能成分应用于各种配方食品，以满足特定人群需求。

使用酶解法制备生物活性肽的优势在于其反应迅速、反应条件温和，在反应过程中通常不会产生副产物，并且在反应过程中不使用化学合成药物，虽然这是一种经过充分研究且很可靠的生物活性肽的生产方法，但也存在一些缺点，例如在使用酶解法制备生物活性肽时，酶与底物比、反应时间、pH值和反应温度等因素均会影响肽的分子质量和氨基酸组成，从而影响其生物活性。同时当使用酶解法制备生物活性肽时，通常对底物进行预处理，如加热处理，这也会导致蛋白质变性以及一些氨基酸受损，并且酶解过程中需要不断添加酸或碱来调节pH值，引入的无机盐增加了肽分离纯化的难度。最后，与发酵等其他工艺相比，酶解法成本昂贵，并且需要特殊的方法来保持其活性。

6.2 微生物发酵法

利用微生物发酵制备生物活性肽应用最广泛的两种方法是液态发酵和固态发酵，其中固态发酵适用于对水分需求较少的真菌，液态发酵适用于具有高水位活性的微生物，并且具有生成的生物活性肽易于纯化等优势。与传统酶解法制备的生物活性肽相比，微生物具有高度多样性的、高活性的蛋白酶，在制备肽的过程中不同的酶在一系列反应中混合作用于原料，而不是像酶水解中只有1种蛋白酶起作用，因此，使用微生物发酵法制备生物活性肽的酶解效率高，且制备得到的肽具有更高的生物活性。使用“GRAS”微生物从可食用蛋白中制备得到的生物活性肽被认为更安全、更健康，同时通过微生物发酵也可以增加所用底物的价值，降低活性肽的生产成本，并改善食品的感官、营养和健康特性。

另一方面，苦味是生物活性肽的特征之一，这也就意味着它们作为功能性产品的可接受性较低。而微生物代谢产生的肽酶可以水解苦味疏水性氨基酸，与传统酶法相比能够实现生物脱苦，从而优化生物活性肽产品的口感和风味。

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乳源生物活性肽的应用现状及展望

随着经济与科学技术的发展，人们对食物的需求由温饱转向合理膳食。乳源生物活性肽因其潜在的健康益处，多被应用于功能性食品或膳食补充剂中，同时乳源蛋白因来源广泛、价格低廉等特点也使乳源生物活性肽在应用方面具有广阔的前景。例如添加了乳源降压肽的乳制品在美国、日本、荷兰等国家均已上市；在婴儿配方乳粉中添加适量的乳源抗菌肽有助于提高婴幼儿对病原微生物的抵抗力，抗菌肽也在婴幼儿的肠道中发挥着抗菌与提高免疫力的作用。除此之外，具有促进骨骼发育、预防骨质疏松作用的酪蛋白磷酸肽也被广泛应用在儿童或中老年保健/功能食品中。

使用发酵法制备乳源生物活性肽时，不同微生物蛋白酶的差异化导致了生物活性肽的多样性。目前，乳蛋白中新的生物活性肽及其在发酵乳制品中的生理功能仍在不断扩增，制备工艺的高效性和安全性是实现生物活性肽产业化的关键因素，在后续的发展过程中应以研究和理论为基础，将各种乳源生物活性肽表现出的促健康作用标准化、产品化。

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结 语

虽然很多研究表明摄入乳源生物活性肽有利于维持人体健康，但肽在人体内的应用仍然存在着一些潜在的生物学问题，例如其在人体中的稳定性、生物利用度和功效等问题。大量鉴定出来的乳源生物活性肽仅停留在研究阶段，且对其活性的研究局限于体外模型，体内活性研究较少，同时也缺乏对活性肽作用机制的研究，肽的构效关系也有待阐明。解决这些问题可以使人们更加充分地理解乳源生物活性肽在人体健康中的作用，并有望从乳蛋白中提取出新的生物活性肽。随着研究的不断深入，乳源生物活性肽的研究前景和方向将更加广阔，并对食品和医疗保健行业产生重大影响。

作者简介

通信作者：

姜淑娟副教授

大连工业大学食品学院

博士，硕士生导师，澳大利亚昆士兰大学访问学者，大连市青年科技之星，辽宁省百千万人才工程“万人层次”。一直致力于乳品与益生菌领域研究，主持完成国家自然科学基金、辽宁省自然科学基金、辽宁省教育厅高校科研重点攻关项目、大连市高层次人才创新项目等项目5 项，作为青年骨干重点参与完成国家十二五重大研发专项子课题2 项，十三五课题1 项、子课题1 项，现主持十四五重大专项子课题1项，辽宁省教育厅高等学校科研重点攻关项目1项，荣获大连市科技进步二等奖、中国轻工业协会科技进步三等奖，中国乳制品工业协会技术发明二等奖各1 项，以第一或通信作者发表研究论文50余篇，申请专利6 项。

第一作者：

李思怡博士研究生

大连工业大学食品学院

研究方向为乳蛋白功能肽，目前以第一作者在食品科学期刊发表EI收录论文1 篇，并以第一作者在Food Science & Nutrition期刊发表SCI收录论文2 篇。

本文《微生物发酵法制备乳源生物活性肽研究进展》来源于《食品科学》2023年44卷21期312-321页. 作者：李思怡，姜雨彤，妥彦峰，吴晓萌，牟光庆，姜淑娟. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221104-047. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方 阅读原文 即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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