四川大学耿佳团队开发用于高效检测单链DNA和基因组DNA的新方法

具有双重功能的CRISPR - Cas系统提供了精确的序列识别和高效的催化切割核酸，使其在生物传感和诊断技术中极具应用前景。然而，目前的方法面临着复杂、周转效率低、需要精心设计探头等挑战。

2024年3月13日，四川大学耿佳团队在Nucleic Acids Research上在线发表题为“An autocatalytic CRISPR-Cas amplification effect propelled by the LNA-modified split activators for DNA sensing”的研究论文，为了更好地整合Cas蛋白的双重功能，该研究提出了一种新的方法，称为LNA修饰的分裂激活子驱动的CRISPR - Cas自催化扩增( CALSA )，用于高效检测单链DNA ( ssDNA )和基因组DNA。

通过引入拆分的ssDNA激活剂和LNA修饰介导的定点反式切割，构建了基于Lb Cas12a系统的自催化驱动的核酸正反馈环路。因此，CALSA可以实时检测不同肿瘤细胞系的基因组DNA和游离DNA ( cell-free DNA，cf DNA )。值得注意的是，CALSA具有高灵敏度、单碱基特异性和极短的反应时间。由于核酸回路的高度可编程性，这些结果突出了CALSA作为级联信号放大的有力工具的巨大潜力。此外，灵敏度和特异性进一步强调了CALSA在生物传感和诊断方面的价值，为未来的临床应用开辟了道路。

基于分子生物学和生物化学反应的信号放大由于DNA / RNA的可编程和自主的相互作用及其多样的酶促转化，在生物传感和生物工程领域引起了极大的兴趣并显示出相当大的潜力。作为金标准的热循环所需聚合酶链式反应( PCR )的有力替代品，一些等温信号放大方法，包括聚合酶和切口酶参与的DNA循环，杂交链式反应，催化发夹组装和熵驱动催化，促进了生物传感在临床和实验室环境中的大量应用，以实现快速、经济和高效。然而，尽管这些等温方法有许多优点，但也有其固有的局限性。它们大多依靠ssDNA而不是未经处理的基因组双链DNA ( dsDNA )作为输入信号和回路元件进行扩增。这种限制阻碍了广泛的临床靶标的检测。此外，这些方法中的许多涉及多步反应回路，并表现出低的转化率，从而阻碍了便利性和放大效率。因此，迫切需要开发新的信号放大方案，采用新的回路模块和机制，实现对各种信号输入的灵敏响应，并扩大诊断的实际应用。

CRISPR 系统是一种原核适应性免疫系统，通过靶向基因组位点，降解入侵的核酸，在原核免疫中发挥防御作用。CRISPR相关( CRISPR-associated，Cas )蛋白能够实现精确的序列识别和高效的催化切割核酸，极大地扩展了我们用于高度特异性基因编辑的工具包。最近发现，一些Cas12或Cas13家族成员蛋白对侧链ssDNA和dsDNA或RNA具有靶向装载激活的非经典反式切割核酸内切酶活性，称为反式剪切。利用ssDNA探针上反式剪切(二级表观常数> 106s-1M-1)的高周转率和dsDNA探针的低背景泄漏，已经建立了许多生物催化信号放大方法，用于开发用于超灵敏核酸检测的下一代诊断技术。例如，通过结合基于聚合酶的额外指数扩增和Cas蛋白反式切割的线性信号扩增，创新性地开发了诸如SHERLOCK，DETECTR，HOLMES和其他的方法，用于检测目标基因和扩展的非核酸分析物，具有原子灵敏度和单碱基错配特异性。

虽然引入环介导等温扩增( loop-mediated isothermal amplification，LAMP )和重组酶聚合酶扩增技术( RPA )等核酸前扩增策略可以进一步增强基于Cas的方法的实用性并显著提高灵敏度，但这些方法仍然存在显著的缺点。反应中复杂的成分使得检测体系错综复杂，也可能会导致错误的结果。如前所述，Cas蛋白，如Cas12a，具有精确的序列识别和高效催化切割核酸的双重功能。这一特性在理论上使Cas12a成为一个潜在的可编程平台，可集成到自催化驱动的核酸回路中，提供了一种比超灵敏度开关更简单的扩增策略。

最近一种名为CONAN的de novo方法利用Cas12a自催化驱动的人工反应网络来创建具有指数动力学的正反馈回路，从而在生物传感应用中展示了巨大的前景。该方法代表了CRISPR/Cas系统在自放大正反馈信号放大方面的成功应用。然而，尽管通过这种方法取得了前所未有的进展，但它也面临着与信号的指数动力学有关的挑战，这些挑战由于严重依赖核酸元件二级结构的变化来启动反应而受到阻碍。此外，复杂的RNA/DNA杂合体探针的设计进一步增加了复杂性，并提高了扩大该方法实用性的阈值。

文章模式图（图源自Nucleic Acids Research）

因此，本研究旨在通过在LbCas12a系统中引入裂开型ssDNA激活剂和LNA修饰介导的定点反式切割来克服上述限制，并开发一种由LNA修饰的裂开型DNA诊断激活剂驱动的理想化CRISPR - Cas自催化扩增方法( CALSA )。CALSA利用LNA修饰的拆分激活剂和具有发夹结构的天然拆分ss DNA作为信号放大的关键元件，有效地将Lb Cas12a系统改造成可编程和自催化驱动的核酸回路。在CALSA中，微量的激活通过具有自我报告能力的信号元素的正反馈回路引发爆发式放大。

该方法实现了LbCas12a系统提供的严格的靶标识别和高效的反式切割活性双重功能的完美结合。CALSA实现了基因组DNA和无细胞DNA ( cell-free DNA，cf DNA )的一酶一锅法实时检测，灵敏度高，单碱基特异性强，检测时间短( 1 h )。为了验证其通用性和分析性能，使用了来自不同肿瘤细胞系( MCF - 7、HeLa和HEK293T细胞)的合成基因( dsDNA )和cfDNA ( ssDNA )。综上所述，CALSA在高灵敏度和高特异性的核酸诊断领域是一个强大而有前途的工具。通过利用LbCas12a系统的独特特征，并结合分裂激活剂和LNA介导的定点切割，成功地解决了信号放大方法的局限性。

参考信息：

https://doi.org/10.1093/nar/gkae176