经典思路不过时-南方医大:代谢组学+网药揭示甘草黄酮调控PI3K/AKT信号通路抑制细胞凋亡改善胃溃疡

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导读

中药甘草是植物甘草、胀果甘草和光果甘草的干燥根和根茎，最早见于《神农本草经》。甘草黄酮（LF）是从中药甘草中分离得到的主要化合物，对治疗胃溃疡（GU）有重要作用。然而，需要进一步探讨其根本机制。本研究旨在采用综合方法研究并进一步阐明LF对抗乙醇诱导GU的机制，在乙醇诱导的胃损伤大鼠模型中评估LF的抗GU作用；然后，应用代谢组学方法来探索特定的代谢产物和代谢途径；接下来，采用网络药理学与代谢组学相结合的策略来预测LF对GU的靶点和途径；最后，通过分子对接、实时聚合酶链式反应和蛋白质印迹验证了这些预测。LF对胃损伤有积极影响，并调节GU相关因子的表达。通过血清代谢组学分析，我们确定了LF处理GU中的25种代谢生物标志物，主要参与氨基酸代谢、碳水化合物代谢和其他相关过程；随后，构建了一个“成分-靶向代谢产物”网络，揭示了可能与GU治疗相关的六个关键靶点（HSP90AA1、AKT1、MAPK1、EGFR、ESR1、PIK3CA）。更重要的是，KEGG分析强调了包括关键靶点在内的PI3K/AKT通路的重要性，作为LF发挥抗GU作用的关键途径。分子对接分析证实，LF的关键成分对关键靶点表现出很强的亲和力。此外，实时PCR和蛋白质印迹结果表明，LF可以逆转这些靶点的表达，激活PI3K/AKT通路，并最终减少细胞凋亡。LF对乙醇诱导的胃溃疡具有胃保护作用，其治疗机制可能涉及通过PI3K-AKT途径改善代谢和抑制细胞凋亡。

研究热点：

1. LF减轻了乙醇对胃组织的损伤；

2. 确定了11种代谢途径中涉及的潜在代谢产物；

3. PI3K/AKT信号激活参与LF对GU的保护作用；

4. LF可抑制胃黏膜细胞凋亡。

论文ID

原名：Licorice flavonoid ameliorates ethanol-induced gastric ulcer in rats by suppressing apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway

译名：甘草黄酮通过PI3K/AKT信号通路抑制细胞凋亡，改善乙醇性大鼠胃溃疡

期刊：Journal of Ethnopharmacology

IF：5.4

发表时间：2024.01

通讯作者：刘强&朱红霞

通讯作者单位：南方医科大学

实验设计

实验结果

1. LF成分分析

我们通过UPLC ESI Orbitrap MS在正离子模式和负离子模式下分析LF中化学成分的特征（图1）。表2中列出了具有碱性类黄酮结构的主要成分。

表1 RT-PCR的引物序列

表2 LF的化学成分

图1 LF中化学成分的识别

（A）LF正离子模式的质谱图。（B）LF负离子模式的质谱图。

2. 宏观检查

如图2B和C所示，与正常（NC）组相比，给予乙醇导致胃损伤，表现为多发性线性出血、局灶性糜烂和溃疡指数显著升高（p＜0.0001）。然而，与GU组相比，我们在LF（150 mg/kg和300 mg/kg）或奥美拉唑（OME）给药中观察到黏膜出血条纹的长度和数量显著减少，表明LF对溃疡的改善。此外，LFH具有与阳性对照药物相当的胃保护潜力。

图2 LF对乙醇诱导大鼠胃溃疡的保护作用。（A）实验设计。（B）宏观代表性图像。（C）不同组中的UI指数（n = 8）。（D）胃组织的H&E染色（橙色箭头：胃上皮细胞丢失；蓝色箭头：局灶性坏死；绿色箭头：出血性损伤；红色箭头：黏膜下水肿；黑色箭头：炎症细胞浸润）。（E-H）胃组织中MDA、GSH、SOD和CAT的水平（n = 5）。（I-M）胃组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κb和Iκbα的mRNA表达（n = 5）。（N-O）血清和胃组织中NO的水平（N = 5）。#p< 0.05，##p < 0.01，###p < 0.001，以及####p < 0.0001与NC组相比；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和***p < 0.0001与GU组相比；与LF 150 mg/kg组和OME组相比，@p＜0.05、@p＜0.01。

3. 组织病理学检查

H&E染色证实了LF减轻乙醇诱导的胃黏膜损伤的能力，而NC组显示出完整的胃黏膜结构和整齐排列的胃腺（图2D）。如箭头所示，乙醇诱导了一系列明显的损伤，其特征是局灶性坏死、黏膜出血性损伤、黏膜下水肿、炎症细胞浸润以及上皮细胞损失。然而，与GU组相比，OME、LF（150 mg/kg）和LF（300 mg/kg）组的黏膜损伤显著减轻。总之，研究结果表明LF改善了GU大鼠的组织病理学表现。

4. LF改善氧化应激和炎症

接下来，我们评估了LF对抗氧化应激和抗炎症的影响。如图2E-H所示，与NC大鼠相比，乙醇诱导的大鼠MDA含量显著升高，而GSH、SOD和CAT活性显著下降。然而，OME和LF（150 mg/kg、300 mg/kg）处理将上述抗氧化因子逆转至正常水平。此外，OME、LFL和LFH均显著逆转了乙醇引起的NF-κb、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的升高以及Iκbα水平的降低（图2I-M）。

5. 血清和胃组织中NO的水平

如图2N-M所示，与NC大鼠相反，GU大鼠血清和胃组织中的NO浓度显著降低（p < 0.001)。同时，LF（150 mg/kg、300 mg/kg）能够以剂量依赖的方式显著恢复NO浓度。

6. 代谢组学分析

在这一部分中，我们基于液相色谱-质谱法（LC-MS）对NC、GU和LFH组的血清分析了非靶向代谢组学图谱。QC样品在正离子和负离子检测模式下的总离子色谱（基峰）如图3A和B所示，表明仪器是稳定的。经过峰校正和组内去除缺失值 > 50%的离子峰，我们分别以正离子和负离子模式去除了499和377种代谢物。PLS-DA在NC组、GU组和LFH组之间有明显的代谢物聚集（图3C和D）。我们发现GU组与NC组的距离最远，然而，LFH组有接近NC组的趋势，表明乙醇引发了代谢产物的变化，LF（300mg/kg）处理在内源性物质含量迁移到正常水平方面发挥了作用。

图3 NC、GU和LFH组的QC样本检验和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。ESI+模型（A）和ESI-模型（B）中QC样品的基峰。ESI+模型（C）和ESI-模型（D）的PLS-DA分析（n=8）。

NC组与GU组和GU与LFH组的OPLS-DA评分图显示出明显的分离（图4）。此外，我们还进行了200置换检验，以验证OPLS-DA模型的可靠性。结果表明，Q2回归线的截距小于0，表明根据实验数据建立的OPLS-DA模型没有过拟合，该模型在筛选差异代谢物方面具有较高的可靠性。

图4 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）以及NC、GU和LFH组（n=8）的OPLS-DA生成的200次置换检验。ESI+中的OPLS-DA，（A1）NC组与GU组，（B1）GU组与LFH组；ESI组OPLS-DA，（C1）NC组与GU组，（D1）GU组与LFH组。OPLS-DA模型在ESI+模式下的200次置换检验，（A2）NC组与GU组，（B2）GU组与LFH组；在ESI-模式下，（C2）NC组与GU组，（D2）GU组与LFH组。

根据OPLS-DA获得的VIP>1.0和p值＜0.05，共有165种代谢产物被定义为差异代谢产物。与NC组相比，GU组分别有49种和22种代谢产物被显著诱导和抑制。然而，LF部分逆转了乙醇诱导胃损伤的代谢变化，消除了GU大鼠的25种代谢变化，其中16种下调，9种上调。因此，这25种代谢产物被定义为LF保护作用的关键生物标志物。表S1中总结了这些生物标志物不同组中相应的化合物名称、质荷比（m/z）、分子式、保留时间和变化趋势。与LF处理相比，乙醇诱导改变的差异代谢产物通过热图可视化（图5A）。

图5 LFH治疗GU大鼠的热图和潜在代谢组学途径。（A）与GU大鼠相比，LFH改变的差异代谢产物的热图。（B）LFH改变的生物标志物的通路分析。1：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；2：抗坏血酸和aldarate代谢；3：烟酸和烟酰胺代谢；4：酪氨酸代谢；5：戊糖和葡萄糖醛酸相互转化；6：卟啉和叶绿素代谢；7：色氨酸代谢；8：组氨酸代谢；9：精氨酸和脯氨酸代谢；10：缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解；11：谷胱甘肽代谢。（C）LFH处理GU大鼠的代谢网络。红色粗体的代谢物是GU大鼠与NC组相比的生物标志物。蓝色“↑”表示与GU组相比，代谢产物被LFH增加；红色“↓”表示与GU组相比，代谢产物被LFH降低。

图6 结合代谢组学和网络药理学分析。（A）LF靶点和差异代谢物靶点之间的重叠。（B）“成分-靶点-代谢物”相互作用网络。橙色点表示LF的成分。三角形表示不同的代谢物。蓝点代表LF对抗GU的潜在靶点。（C）潜在靶点的PPI网络。（D）GO分析和（E）KEGG途径富集的潜在靶点。

为了进一步研究LF改善胃溃疡的可能机制，我们在MetaboAnalyst5.0中引入了不同的代谢产物(https://www.metaboanalyst.ca/)用于途径富集。如表3和图5B所示，共富集了11条代谢途径。在途径影响>0.1的条件下，五种代谢途径被认为是关键的代谢途径，包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢以及辅因子和维生素的代谢。代谢物网络和相关途径如图5C所示。

表3 代谢途径影响分析

7. 结合代谢组学和网络药理学分析

7.1 “成分-靶点-代谢物”网络

如图6A所示，我们在LF靶点和潜在代谢物相关靶点之间鉴定出176个重叠靶点。使用Cytoscape（版本3.10.0）软件，建立了一个“成分-靶点-代谢物”网络，以说明LF和差异代谢物之间的复杂关系（图6B）。根据节点degree，我们筛选出显著的活性成分。LF中更重要的成分是甘草素、甘草黄酮A、甘草查尔酮A、甘草查尔酮B和Echinatin，在degree上排名前五。这表明这些活性成分对正常代谢产物和胃保护至关重要。

7.2 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)和富集分析

为了进一步探讨LF抗胃溃疡的潜在机制，我们建立了由176个节点和414条边组成的PPI网络（图6C）。如图所示，热休克蛋白90α家族A类成员1（HSP90AA1）（D = 33）、苏氨酸激酶1（AKT1）（D = 32）、有丝分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）（D = 29）、表皮生长因子受体（EGFR）（D = 26）、雌激素受体1（ESR1）（D = 21）和磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α（PIK3CA）（D = 18）在PPI网络中占据核心地位，被认为是LF治疗胃溃疡的核心靶点。此外，生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）中按p值排序的前十个富集GO项如图6D所示，提示LF可能影响炎症反应、细胞凋亡过程的负调控、质膜、胞质溶胶、锌离子结合和酶结合。基于KEGG富集分析（图6E），LF可能在调节PI3K-AKT信号通路、Rap1信号通路、HIF-1信号通路和MAPK信号通路中发挥重要作用。

8. 分子对接

此外，我们还采用分子对接方法分析了LF的五种核心成分与六种核心靶点（HSP90AA1、AKT1、MAPK1、EGFR、ESR1、PIK3CA）之间的相互作用。更稳定的配体-受体配置需要更低的结合能，这反映在对接得分中。如前所述，小于-5.0 kcal/mol的对接得分表明配体和受体之间具有良好的结合活性。如表S2所示，所有核心靶点，特别是AKT1和PIK3CA，对LF中的治疗成分具有良好的结合亲和力（对接得分＜−5.0 kcal/mol）。每个靶点的最佳对接结果进一步显示为3D和2D结合图（图7）。核心成分与关键靶点形成稳定的复合物，例如，甘草黄酮A与与AKT1结合的氨基酸残基GLN79和ASN54形成两个氢键。甘草黄酮A-PIK3CA复合物通过一个氢键稳定在氨基酸残基上。

图7 三维和二维对接模型的关键靶点的最优对接结果。（A）甘草查尔酮A-HSP90AA1；（B）甘草黄酮A-AKT1；（C）甘草黄酮A-MAPK1；（D）甘草黄酮A-EGFR；（E）甘草查尔酮B-ESR1；（F）甘草黄酮 A-PIK3CA。

9. LF对潜在靶点的影响

我们使用RT-qPCR检测上述关键靶点，以探讨它们是否参与LF在GU中介导的作用。如图8所示，GU组HSP90AA1、AKT1、MAPK1、EGFR、ESR1和PIK3CA的表达均受到显著抑制，而在LF给药中观察到上述基因的显著增加，提示LF可以调节这些核心基因的表达。

图8 网络药理学关键靶点验证结果n = 5。（A）HSP90AA1、（B）AKT1、（C）MAPK1、（D）EGFR、（E）ESR1、（F）PIK3CA的mRNA表达。#p< 0.05，##p < 0.01，###p < 0.001与NC组相比；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p < 0.0001与GU组相比；和@p < 0.05，与LF 150mg/kg组和OME组相比。

10. LF激活PI3K/AKT通路，减轻胃细胞凋亡

新出现的证据表明，摄入乙醇可能会抑制PI3K-AKT信号通路，然而，PI3K-AKT的激活与促进葡萄糖代谢、参与细胞增殖和黏膜修复有关。如图9A-E所示，与NC组相比，GU组的p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT水平明显受到抑制（p < 0.05)，而与GU组相比，LF给药有效地增强了这些蛋白质的表达（p < 0.05)。为了验证PI3K/AKT通路是否参与LF抑制细胞凋亡，我们检测了下游凋亡相关蛋白。我们发现，两种剂量的LF给药都可以逆转Bax和胱天蛋白酶-3的增加，以及乙醇灌胃诱导的Bcl-2下调（图9F-H）。

图9 LF可诱导PI3K/AKT通路的激活并减弱细胞凋亡（n = 3）。（A-H）通过蛋白质印迹测定p-PI3K、PI3K，p-AKT、AKT、Bax、Bcl-2和Caspase-3的蛋白质表达水平。β-肌动蛋白作为内部对照。（I）TUNEL染色结果。#p< 0.05，##p < 0.01，###p < 0.001与NC组相比；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和***p < 0.0001与GU组相比；@p <0.05 与LF 150mg/kg组相比。

然后，我们通过TUNEL染色观察胃黏膜细胞的凋亡变化。凋亡细胞在GU组中增加，而在LF处理组中减少（图9I）。研究结果有力地表明，LF可以通过激活PI3K/AKT通路抑制细胞凋亡来减轻GU。

GU是一种多因素的胃肠道疾病，乙醇是引起胃溃疡的主要诱因之一。奥美拉唑等常用药物的临床治疗需求因其不良反应而受到限制。甘草是中医系统中最突出的材料之一，传统上用于多种调节消化系统的制剂，甘草黄酮类化合物主要用于治疗胃和十二指肠溃疡。此外，甘草作为最常用的“药食同源”草药之一，可以为GU治疗提供高效低毒的疗效。鉴于目前尚不清楚LF的作用机制以及LF抗溃疡是否与调节代谢有关，因此我们采用基于UPLC-Q-TOF/MS的代谢组学和网络药理学相结合的方法来研究LF治疗GU的潜在基因和潜在机制。根据血清代谢组学分析，LF可以部分逆转乙醇诱导的胃损伤中涉及的代谢途径，尤其是参与葡萄糖利用的氨基酸代谢。此外，代谢组学结合网络药理学表明，PI3K-AKT信号通路是LF改善GU的潜在途径之一。更重要的是，LF通过激活PI3K/AKT通路来减弱胃细胞凋亡，这与预测的结果一致。

由于乙醇诱导的GU发病机制与人类非常相似，因此我们在研究中使用该模型来评估LF的胃保护作用。在给予高浓度乙醇后，GU组的黏膜受到显著损伤，出现多条不规则出血带，溃疡指数显著升高。从宏观和微观观察来看，LF能促进胃修复，减少病理损伤，说明LF对胃溃疡有一定的治疗作用。先前的研究已经证实，氧化应激和炎症反应是酒精诱导的胃黏膜损伤的必然特征。氧化应激的代谢产物MDA表明自由基激活的脂质过氧化介导细胞损伤。此外，GSH、SOD和CAT被认为是保护性介质，可以清除自由基，抑制脂质过氧化，保护细胞免受损伤。更重要的是，过度的氧化应激会诱导IκBα的泛素化和降解，以及随后的NF-κB活化，使其自由易位进入细胞核；接下来，它促进以促炎细胞因子水平为代表的侵袭性因子的产生，如TNF-a、IL-6和IL-1β。先前的研究表明，LF在各种疾病中具有抗氧化和抗炎能力，我们的研究结果还表明，LF逆转了乙醇摄入后胃中MDA含量增加、GSH含量降低、SOD和CAT活性降低的现象。此外，LF下调NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6的mRNA水平，上调IκBα，从而对GU发挥抗炎作用。

NO作为一种内源性血管舒张物质，通过血管舒张和促进血液流动，在维持黏膜完整性和黏膜防御方面发挥着直接作用。此外，已经证明NO对大鼠胃肠黏膜细胞具有抗凋亡作用。与之前的研究一致，我们的研究结果表明，LF显著改善并将NO水平保持在正常范围内，表明其对黏膜完整性有有益影响。

随后，我们研究了LF在GU治疗中的代谢组学。最终，我们初步鉴定出25种不同的代谢产物，包括酪氨酸、烟酰胺、亚精胺、丝氨酸、3-羟基邻氨基苯甲酸酯，它们参与11种代谢途径。其中，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成（影响 = 0.5）、抗坏血酸和aldarate代谢（影响 = 0.25），烟酸和烟酰胺代谢（影响 = 0.194），酪氨酸代谢（影响 = 0.139），以及戊糖和葡萄糖醛酸相互转化（影响 = 0.125）是非常重要的。

先前的研究强调了氨基酸代谢紊乱对异常生理功能的影响及其在GU发展中的作用。苯丙氨酸羟化酶催化苯丙氨酸转化为L-酪氨酸，L-酪氨酸进一步转化为多巴胺。多巴胺是胃的保护因子，对胃肠运动、胃黏膜血流量和胃酸分泌具有调节作用。大量证据支持通过调节多巴胺可以改善胃溃疡。L-色氨酸是蛋白质合成的必需氨基酸，参与炎症、氧化应激和免疫的调节，其代谢紊乱可能导致神经系统功能障碍，进而影响胃肠系统的功能。此外，色氨酸通过犬尿氨酸途径的代谢过程导致烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的从头合成，影响烟酰胺代谢途径。3-羟基邻氨基苯甲酸是色氨酸的下游代谢产物，是L-色氨酸转化为烟酰胺的限制因素。在本研究中，GU组的酪氨酸、色氨酸和3-羟基邻氨基苯甲酸水平发生了显著变化，而LF使代谢产物正常化，表明LF可能通过恢复氨基酸代谢破坏在胃黏膜中发挥保护作用。

烟酰胺参与体内糖酵解、脂肪酸合成、三羧酸循环和组织呼吸的氧化过程。研究表明，烟酰胺具有胃保护作用，可能通过增强胃微血管通透性及其抗氧化特性发挥作用。NAD+由烟酰胺合成，是一种关键的细胞内氧化还原辅因子，也是多种代谢酶的底物。NAD+的失调与多种疾病的发生密切相关。目前的研究表明，与NC组相比，GU组的烟酰胺异常减少，表明该生物体的氧化还原能力在GU大鼠中受到抑制。然而，LF恢复了烟酰胺的水平，提高抗氧化能力，从而修复胃黏膜。

结合代谢组学和网络药理学策略，我们进一步探讨了LF治疗GU的机制。通过构建“成分-靶点-代谢产物”网络，发现了6个关键靶点（HSP90AA1、AKT1、MAPK1、EGFR、ESR1、PIK3CA），它们都与GU的发病机制密切相关。此外，KEGG分析表明，PI3K/AKT信号通路可能在LF减轻胃溃疡中发挥重要作用。

一方面，葡萄糖代谢是维持能量来源的重要途径，尤其是在胃溃疡修复过程中，它高度依赖于葡萄糖的利用。活化的AKT增强葡萄糖的转运，PI3K/AKT信号激活诱导葡萄糖激酶表达增加并促进葡萄糖代谢。LF调节的烟酸和烟酰胺代谢以及苯丙氨酸代谢也参与糖酵解途径，促进能量代谢，提示LF可以通过PI3K/AKT途径调节代谢，促进胃黏膜修复。

另一方面，研究证明这些关键靶点与PI3K/AKT信号通路以及胃肠道疾病有关。众所周知，EGFR对促进伤口愈合、促进黏膜和腺体再生至关重要，其激活可抑制胃黏膜细胞的凋亡，从而显著加速GU的修复。MAPK1是由PI3K诱导的EGFR的下游，与上皮增殖和黏膜修复增强有关。基于我们之前的研究，已经证实LF可以通过激活EGFR/ERK途径促进上皮细胞的增殖和胃黏膜的修复来减轻GU。ESR1编码雌激素受体ERα和配体激活的转录因子。类黄酮与雌激素结构相似，被称为植物雌激素，通过雌激素受体ERα和ERβ发挥抗氧化机制和抗炎作用，缓解胃溃疡。此外，当ERα与雌激素结合时，它会导致MAPK1/2、PI3K和AKT的激活。PIK3CA和AKT1被认为是PI3K/AKT信号通路中的关键节点，在调节细胞存活、增殖、迁移和凋亡中发挥着至关重要的作用。

过度的细胞凋亡会破坏黏膜的完整性，最终导致黏膜损伤。凋亡抑制蛋白Bcl-2控制线粒体膜通透性，通过阻止细胞色素C释放到细胞质中来抑制细胞凋亡。Bax是促凋亡的代表，具有与Bcl-2相反的功能，刺激凋亡小泡的形成，并最终激活凋亡执行子Caspase-3，导致细胞凋亡。我们的研究表明，在乙醇诱导的GU大鼠胃组织中，促凋亡的Bax和胱天蛋白酶-3显著增加，Bcl-2受到抑制，但LF激活了PI3K/AKT通路，随后下调了Bax、胱天蛋白酶3的蛋白表达，并上调了Bcl-2。此外，TUNEL染色也证实了LF可以防止乙醇诱导的胃黏膜细胞凋亡。上述证据表明，LF可能通过PI3K/AKT信号通路预防细胞凋亡损伤并维持胃黏膜完整性。

结论

总之，LF通过减少氧化应激和炎症、调节代谢、抑制胃黏膜细胞凋亡，对GU发挥胃保护作用。更重要的是，LF通过抑制细胞凋亡和通过激活PI3K/AKT途径维持胃黏膜完整性来改善乙醇诱导的GU。本研究对探讨LF的抗胃溃疡作用及其机制具有重要意义，提示其具有成为胃黏膜保护剂的潜力。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38301986/

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