世界首次！乔治·丘奇团队成功构建大象iPS细胞，距离复活猛犸象更进一步

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

日前，Colossal Biosciences宣布成功重编程大象（亚洲象）诱导多能干细胞（iPSC），将大象的成熟皮肤细胞重编程为胚胎状态，这项研究是实现其复活猛犸象项目的重要里程碑。Colossal 由乔治·丘奇（George Church）等人创立，是第一家将CRISPR技术应用于物种恢复、极度濒危物种保护及关键生态系统重建的公司。

该研究于2024年3月6日在预印本平台 bioRxiv 发布【1】，论文题为：Derivation of Elephant Induced Pluripoten Stem Cells。

Colossal Biosciences生物科学负责人Eriona Hysolli博士分享道：“过去，许多生成大象iPSCs的尝试都没有取得成果。大象是一个非常特殊的物种，我们只是刚刚开始触及它们基本生物学的表面。”

2006年，山中伸弥在Cell期刊发表论文【2】，首次阐明通过表达四种转录因子（Oct3/4、Sox2、Myc、Klf4，简称为山中因子），可将成熟体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC）。山中伸弥也因此获得了2012年诺贝尔生理学或医学奖。

如今，该技术已成功在包括人类在内的许多物种中成功实现了iPSC的诱导，然而，大象的iPSC却始终未获成功。

在这项研究中，研究团队首先使用化学诱导培养基，然后添加转录因子Oct4、Sox2、Klf4、Myc +/- Nanog和Lin28，并抑制p53通路，成功实现了迄今为止最成功的大象诱导多能干细胞重编程。

该研究所使用的重编程方法与常用方法有所不同，部分原因是大象p53通路的复杂性。众所周知，p53是最重要的抑癌基因，我们人类有两个p53基因拷贝，超过一半的癌症患者存在p53基因突变。而大象基因组中有着多达19个p53基因拷贝，这可能是大象如此长寿且体型巨大却不患癌症的重要原因。

此外，重编程对于高等哺乳动物来说相当耗时且低效，对于大象来说需要更长的时间。但是，该研究成功实现的诱导多能干细胞表达了多个核心多能因子，并可以分化成三个胚层，这些胚层随后会产生身体中的每个细胞类型。这些新重编程的诱导多能干细胞已经通过免疫染色、多能性和分化标志物的PCR、转录组学分析、胚胎体和畸胎瘤形成进行了验证。此外，该研究也有助于深入解析大象不患癌症的原因，从而为人类癌症的研究和治疗带来新见解。

Colossal 公司计划在此基础上创造第一批基因编辑大象，通过对上述大象iPSC的多重编辑和再分化，识别和研究让大象产生猛犸象特征所需的基因变化，从而在细胞和类器官水平上研究猛犸象的寒冷适应性状，例如毛发生长和脂肪储存。

Colossal 公司最终希望将基因编辑的iPSC再分化为精子和卵子，进而制造出胚胎，孕育出猛犸象。为了避免使用大量大象代孕这些胚胎，乔治·丘奇的设想是使用人造子宫，从而不必干扰本就已经濒危的大象的自然繁殖。

研究团队表示，取得初步成功后，现在还有更多工作要做，目前正致力于解析为什么大象的细胞重编程如此具有挑战性，这对于将来更快地获得诱导多能干细胞至关重要，以实现更先进的三系分化，特别是体外配子发生，进而测试诱导多能干细胞的全部潜力。

一旦iPSC可以用来建立一个合成大象胚胎的模型，它也将是理解漫长而复杂的大象（以及猛犸象）发育和妊娠周期的一部分。这对 Colossal 公司的复活猛犸象等已灭绝物种的目标至关重要，因为该公司依赖于利用子宫外发育来保护和恢复物种。更重要的是，所有这些科学发展都具有在发育生物学领域扩展的可能性，其影响远远超出了 Colossal 公司现在所做的事。

乔治·丘奇表示，如果有一个“最难重编程奖”，那么大象应该能获奖。但无论如何，学习如何重编程将有助于许多其他研究，特别是对濒危物种的研究。这一里程碑成果为我们提供了关于发育生物学和衰老与癌症之间的平衡的见解。它为在珍稀动物身上不进行手术获取配子和其他细胞类型打开了大门。它为现代动物与其已灭绝亲属之间建立基因和特征之间的联系打开了大门，包括对极端环境和病原体的抵抗力。

乔治·丘奇和他的“侏罗纪公园”计划

1964年，10岁的乔治·丘奇（George Church）在参观世博会时，一个长着长毛的猛犸象动画第一次吸引了他的注意，这也在他心里种下了一颗种子。而如今，50多年过去了，已经成为传奇科学家的乔治·丘奇正在带领团队试图复活这种曾让他充满敬畏的已灭绝的庞然大物。

大约在2005年，乔治·丘奇开始了复活猛犸象的研究计划，而这一计划面临的最大挑战实际上是资金，直到2019年，在这一年，他和Ben Lamm联合创立了一家名为Colosal Biosciences公司，他们计划在2027年之前复活猛犸象。2022年8月，该公司宣布将复活袋狼（又名塔斯马尼亚虎）列入计划。2023年1月31日，该公司宣布将复活渡渡鸟列入计划。

Colosal公司计划复活的三大物种

复活猛犸象

猛犸象，是陆地上生存过的最大的哺乳动物，其中体型最大的草原猛犸象体重可达12吨，是现在亚洲象的3倍。在气候寒冷的更新世（大约公元前180万年至公元前1万年），猛犸象在亚欧大陆背部广泛分布，在2万多年前，据估亚欧大陆一度拥有大约2亿只猛犸象。然而，在距今约1万年前，因为气候变化等原因，适应寒冷气候的猛犸象快速灭绝，大约5000年前，猛犸象彻底灭绝，这也标志着冰河世纪的结束。

随着在西伯利亚冻土层发掘到保存较为完好的猛犸象遗体，复活猛犸象的梦想似乎不再遥不可及。Colosal 公司计划将猛犸象细胞核移植到其亲亚洲象的细胞中，从而创造胚胎，然后通过雌性亚洲象代孕或使用人造子宫，产下猛犸象。

西伯利亚永久冻土层中发现的39000年前的猛犸象幼崽

猛犸象与亚洲象的基因组相差约140万个碱基序列，对应着大约1600多个蛋白质编码基因，乔治·丘奇认为，可能只需要编辑其中数十个基因，就可能解决猛犸象胚胎在代孕亚洲象体内的发育问题。他还表示，目标是制造出能在零下数十度下生存的大象，它的外表和行为都要像猛犸象。

创建一个侏罗纪公园？

如果一切按计划进行，Colosal 公司希望在未来几年内产下第一批猛犸象幼崽。而使用亚洲象代孕的方式，效率太低，因此，Colosal 公司计划通过“人造子宫”来实现大批量生产猛犸象。

而近年来，“人造子宫”的研究取得了一些突破性进展。

2017年4月，美国费城儿童医院的研究人员在Nature Communications期刊发表论文 【3】 ，将一只与人类及早产儿发育程度相当的羔羊在“人造子宫”中继续发育了长达4周时间。羔羊在“人造子宫”中表现出正常的体细胞生长、肺成熟、大脑生长和髓鞘形成。

羔羊在人造子宫中的生长发育：右图为左图的4周后

2021年3月，以色列魏茨曼科学研究所的研究人员在Nature期刊发表论文 【4】 ，该研究创建了一个“人造机器子宫”，并首次使用人造子宫培养了小鼠胚胎6天时间（达到小鼠整个妊娠期的三分之一），且胚胎在人造子宫培育过程中发育正常。

小鼠胚胎可在这个“人造机器子宫”中存活并发育6天时间

猛犸象复原图

Colosal 公司计划在俄罗斯北部建立一个更新世公园，用来释放这些复活的猛犸象，这听起来很像侏罗纪公园，卖票让人们参观一种已于上万年前灭绝的庞然大物似乎一个挣钱的好生意。但 Colosal 公司似乎并不打算这么干，他们的设想是，这些猛犸象会推倒这里树木，踩踏积雪，恢复草原，帮助维持这些冻土地带的冻结状态，从而减少二氧化碳和甲烷等温室气体的释放，减缓气候变暖。目前，它们的研究人员正计划在这里测试再野化对生态和气候影响的理论。

复活渡渡鸟

渡渡鸟标本

在过去50年中，全球鸟类数量已经减少了30亿多只，有400多种鸟类已灭绝、野外灭绝或极度濒危。Colosal 公司之所以选择去复活渡渡鸟，是因为渡渡鸟是一个人类导致物种灭绝的标志性案例，17世纪晚期，这种体型巨大、不会飞的鸟类从毛里求斯岛灭绝，此时距离它们被发现仅仅100多年。渡渡鸟也成为了第一个被记录的因人类活动而导致灭绝的物种。

Colossal 公司复活渡渡鸟（Raphus cucullatus）的计划将从它现存的亲缘关系最近的绿蓑鸠（Caloenas nicobarica）开始，他们计划从绿蓑鸠中分离和培养原始生殖细胞（PGC），然后使用CRISPR基因编辑工具编辑PGC，使其与渡渡鸟的DNA序列相匹配。然后，将这些经过基因编辑的PGC植入代孕鸟类的胚胎中，以产生嵌合体。这些具有渡渡鸟和绿蓑鸠两个物种的DNA的嵌合体，能够产生类似渡渡鸟的卵子和精子，可能进一步孵化出类似渡渡鸟的鸟类。

复活渡渡鸟的项目面临的最大挑战是确定将绿蓑鸠转变为渡渡鸟所需改变的基因，加州大学圣克鲁兹分校古遗传学家Beth Shapiro正在对渡渡鸟的基因组进行测序，进而比较二者的基因差异，她也是复活渡渡鸟项目的科学顾问。她曾在2016年发表论文指出绿蓑鸠和渡渡鸟在3000万-5000万年前拥有一个共同祖先。

然而，现存的渡渡鸟标本都保存在热带地区，这导致其很难获取像保存在永久冻土层的猛犸象那样的完整基因组，测序得到的渡渡鸟基因组可能存在着缺口和错误。此外，即使找到了渡渡鸟与绿蓑鸠之间全部差异基因，将才可能存在的成千上万种基因差异引入PGC中，显然并不容易。即使这些都做到了，经过大量基因编辑的PGC植入代孕鸟类胚胎并让其产生精子和卵子同样充满挑战。目前科学家已经创造出了可以产生鹌鹑精子的嵌合鸡胚胎，但还不能产生卵子。最后，渡渡鸟的体型比绿蓑鸠大得多，显然无法在绿蓑鸠中孵化渡渡鸟，还需要找到一种体型类似的鸟类代孕。

复活袋狼

袋狼

袋狼，也叫塔斯马尼亚虎，是一种大型食肉有袋动物，因被欧洲殖民者大量捕杀而快速灭绝，1936年，最后一只袋狼在动物园死亡。由于灭绝时间较近，袋狼有着保存完好的胚胎和标本，这给复活袋狼奠定了基础。

Colossal 公司复活袋狼的计划由著名袋狼研究专家、墨尔本大学的Andrew Pask教授领衔，再过去20年里，他的团队一直致力于对袋狼进行基因组测序。袋鼬科（Dasyuridae）是袋狼的近亲，它们在进化上与袋狼有7000万年的差异。研究团队希望利用CRISPR基因编辑技术将袋狼基因插入袋鼬科动物基因组中，然后将编辑的细胞核移植到袋鼬科动物卵子中，创建袋狼胚胎，通过代孕动物生下袋狼。

创造一个更美好的世界

Colossal 公司这些雄心勃勃的计划，建立在近年来基因测序技术、基因编辑技术、以及干细胞技术等生物科技巨大飞跃的基础上。但其 CEOBen Lamm也承认，要想实现复活这些已灭绝动物的目标，仍然充满挑战。但他同时表示，这些复活已灭绝动物的工作有助于保护其他动物，能够为动物保护带来许多新技术。

Colossal 公司在其官网表示，Colossal 是一家领先的遗传学和生物技术公司，而不仅仅是一家遗传学和生物技术公司，它的目标是通过恢复已灭绝或即将灭绝的物种，去解决人类进步给地球带来的副作用，创造一个更美好的世界。

此外，Colossal 公司还希望在复活已灭绝动物的过程中，孵化大量创新IP，促进生物技术发展。例如，2022年9月，Colossal 公司孵化了一家名为Form Bio的公司并完成了3000万美元A轮融资，该公司专注于开发计算生命科学平台，为生命科学家提供简单的、用户友好型的管理大型数据集的完整平台，弥合数据和科学发现之间的鸿沟，从而“让科学家在更少的时间和更少的努力下实现发现和突破”。

参考资料：

1. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.03.05.583606v1

2. https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.07.024

3. https://www.nature.com/articles/ncomms15112/

4. https://www.nature.com/articles/s41586-021-03416-3

5. https://colossal.com/