补充医学1区: 长春中医大等以多组学揭示射干麻黄汤对哮喘大鼠的治疗作用机制

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导读

射干麻黄汤（Shegan Mahuang Decoction，SMD）是治疗哮喘的经典中药方剂，但射干麻黄汤的平喘作用机制仍未得到充分研究。

研究目的：建立卵清蛋白（OVA）诱导的哮喘大鼠模型，并给予SMD治疗，观察其抗哮喘作用并探讨其作用机制。

材料与方法：通过检测大鼠血清免疫球蛋白E（IgE）、C反应蛋白（CRP）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-6（IL-6）水平及肺组织切片H&E染色来评价SMD的抗炎作用。使用基于液相色谱-质谱（LC-MS）的非靶向代谢组学和基于TMT的蛋白质组学方法分析了不同组肺组织中代谢物和蛋白质的变化。筛选代谢标志物和差异表达蛋白（DEPs），并对相关信号转导途径进行研究。此外，通过western blotting（WB）实验验证了信号通路上的关键蛋白，揭示了SMD抗哮喘的机制。

结果：SMD能显著降低血清IgE、CRP、IL-4、IL-6水平，减轻OVA引起的肺组织病理改变。从大鼠肺组织中共筛选出34个代谢生物标志物和84个DEPs，主要与脂质代谢、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶活化、活性氧（ROS）过量产生和溶酶体途径相关。此外，SMD还能抑制髓样分化因子88（MyD88）/κB激酶抑制剂（IKK）/核因子κB（NF-κB）信号通路，发挥抗炎作用。

结论：SMD对哮喘的治疗作用可能与抑制MyD88/IKK/NF-κB信号通路有关。

图文摘要

论文ID

原名：Multi-omics analysis of lung tissue metabolome and proteome reveals the therapeutic effect of Shegan Mahuang Decoction against asthma in rats

译名：肺组织代谢组学和蛋白质组学分析揭示射干麻黄汤对哮喘大鼠的治疗作用

期刊：Journal of Ethnopharmacology

IF：5.4

发表时间：2023.12

通讯作者：王洋、李立新

通讯作者单位：长春中医药大学；吉林省中医药科学院第一临床医院

实验设计

实验结果

1. SMD对OVA致大鼠哮喘的影响

通过检测血清中IgE、CRP、IL-4、IL-6水平来评价SMD的抗炎作用。如图2所示，模型组大鼠血清中IgE、CRP、IL-4、IL-6的表达水平较对照组显著升高。地塞米松治疗后，除IL-4外，这些升高的水平显著下调。同时，SMD治疗组血清IgE、CRP、IL-4、IL-6水平也明显下降，与治疗前比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果表明，SMD具有抗炎、平喘作用。

图1.对ova诱导的哮喘模型的实验设计

图2. SMD对OVA诱发哮喘大鼠血清中IgE（A）、CRP（B）、IL-4（C）和IL-6（D）的影响。结果以每组的平均值±标准差表示。采用方差分析和Tukey’s多重比较检验来确定统计学意义。*与对照组比较， *** P <0.001；#与模型组比较， # P <0.05， ## P <0.01， ### P <0.001。

对哮喘大鼠肺组织切片进行HE染色，观察肺组织的形态变化，评价SMD对肺组织的抗炎作用。如图3A所示，对照组大鼠肺组织显示，支气管粘膜上皮完整，管腔规则，粘膜肌层完整，有少量炎性细胞，未见腺体增生。模型组大鼠肺组织炎性细胞严重渗入周围血管和结缔组织，管腔变窄，粘膜增厚。经地塞米松和SMD治疗后，OVA所致的病理改变明显改善。大鼠的气道炎症评分如图3B所示，模型组通过SMD治疗后增加的评分随剂量增加而降低。在三个SMD组中，SMD-H组下降最为显著。这些结果证实了SMD对OVA诱导的哮喘的治疗作用。

图3. SMD对OVA诱导的哮喘大鼠肺组织病理变化的影响。（A）每组具有代表性的肺组织切片的H&E染色图（×200）。红色箭头表示炎症细胞聚集，绿色垂直线表示气道壁厚度。（B）各组气道炎症评分。*与对照组比较，***P<0.001；#与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

2.代谢组学分析

2.1 方法验证

通过多次进样的质量控制（QC）样品，评价了建立的LC-MS方法的重复性和稳定性。为了保证系统的稳定性，首先采集三针质控样品，然后每十个样品进行一次QC进样，以验证所建立的方法。在对原始数据进行预处理后，建立了1035个离子和1377个离子的水萃取物和有机萃取物两个数据集。为验证方法，计算了每次质控进样中离子的相对标准偏差（RSD%）。如图S1所示，水提物和有机萃取物中RSD%<30%的离子分别为81.84%和73.44%，表明建立的LC-MS方法的重现性和稳定性良好。

2.2 肺组织代谢组谱与模式识别

采用LC-MS联用技术对肺组织样品中的代谢物进行了分析。水萃取物和有机萃取物的基峰色谱图如图S2所示。在上述数据采集条件下，代谢物在25~30min的保留时间内得到很好的分离。在不同的群体中发现了几个差异。统计分析不同组间肺组织代谢物的变化，进而评价SMD的疗效。

建立了肺组织样本的偏最小二乘分析模型（PLS-DA），显示了肺组织样本在各组中的分布情况，并直观地显示了分类模式。水萃取物和有机萃取物的R2Y和Q2（CUM）值列于表S1，表明所建立的模型具有良好的适应性和预测性。如图4A和B所示，在得分图中，对照组和模型组之间有明显的分离，表明在建模过程中发生了代谢变化。SMD治疗后，SMD-M组的样本点有脱离模型组和接近对照组的趋势（图4C和D），表明SMD可以部分改变OVA诱导的哮喘大鼠的代谢，从而对哮喘起到治疗作用。

图4. 根据水提物（A，C）和有机提取物（B，D）的数据，绘制对照组、模型组和SMD-M组的PLS-DA得分图。

2.3 生物标志物的筛选及通路富集分析

根据上述标准筛选代谢生物标志物。如表1所列，通过模型组与对照组的比较，确定了34个潜在的生物标记物，其中22个在SMD治疗后逆转。将这22个生物标志物输入MetbraAnalyst 5.0软件进行富集分析。如图5所示，在OVA诱导的动物模型建立过程中，鞘磷脂代谢、甘油磷脂代谢、嘌呤代谢等13条通路受到干扰。

表1 代谢生物标志物的信息及其在组内的变化趋势。

注：模型组与对照组比较， * P <0.05， ** P <0.01， *** P <0.001；SMD-M与模型组比较， # P <0.05， ### P <0.001。根据LC-MS检测到的代谢物的不同加合离子，从CD软件推断出准确的质量。

图5. 潜在生物标志物的代谢途径分析通过气泡图可视化

3.蛋白质组学分析

3.1 差异蛋白质的分析

采用基于TMT的定量蛋白质组学方法对不同组别的肺组织样本进行分析，并根据上述条件选择DEPs。如表2所示，在模型组与对照组的比较中筛选出84个DEPs，这些DEPs被SMD反向调节。通过建立分级聚类热图，观察各组DEPs的表达水平（图6）。与对照组相比，模型组共有67个蛋白质表达上调，经SMD治疗后表达下调。模型组有17个蛋白质水平降低，SMD干预后蛋白质水平升高。这些改变的蛋白可能在SMD治疗哮喘中发挥重要的调节作用。

图6. 热图以可视化不同组中DEPs的趋势

3.2 差异蛋白质的分析

对84个DEPs进行GO注解分析和KEGG通路分析。图7显示了每个GO类别的前10个功能，这表明这些改变的蛋白质主要参与过氧化氢代谢过程、NADPH氧化酶复合体和超氧化物产生NAD（P）H氧化酶的活性。图8列出了前10个KEGG通路，表明与其他通路相比，溶酶体途径相对突出。

图7. DEPs的GO功能分析条形图。

图8. DEPs的KEGG通路富集分析结果。显示了前10个富集的通路

4.蛋白印迹分析

通过WB实验分析MyD88/IKK/NF-κB信号通路上的关键蛋白MyD88、IKK（α）、P-NF-κB（P65）、NF-κB（P65）、P-IκBα和IκBα在肺组织中的表达水平，进一步验证SMD治疗哮喘的作用机制。如图9所示，模型组大鼠肺组织MyD88、IKK（α）、P-NF-κB（P65）、NF-κB（P65）、P-IκBα、IκBα的蛋白表达均高于对照组（P<0.05），治疗后其表达呈下降趋势（P<0.05），提示SMD能调节MyD88/IKK/NF-κB信号通路，抑制哮喘炎症发展。

图9. WB检测MyD88、IKK（α）、P-NF-κB（P65）、NF-κB（P65）、P-IκBα和IκBα的相对蛋白表达（A），并用CB（亲环蛋白B）进行标准化。WB灰度分析（B）。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

SMD是治疗哮喘临床疗效显着的经典方剂，但其作用机制尚不清楚。在这项研究中，我们建立了 OVA 诱导的哮喘模型并接受 SMD 治疗。检测各组血清中IgE、CRP、IL-4、IL-6浓度。H&E染色观察肺组织的组织病理学变化。结果显示，SMD可抑制IgE、CRP、IL-4、IL-6的释放，减少支气管炎细胞浸润和粘液分泌，减轻哮喘气道的炎症反应和病理损伤。

本研究利用LC-MS代谢组学方法，从代谢调节的角度研究SMD的抗哮喘活性及相关代谢。通过OVA模拟，共有34个肺组织代谢物发生显著变化，并被选为潜在的生物标志物，其中22个通过SMD治疗逆转。神经酰胺和溶血磷脂酰胆碱在鞘磷脂和甘油磷脂代谢中起重要作用。模型组经SMD治疗后，这些代谢物的上调调节作用减弱。鞘磷脂代谢和甘油磷脂代谢属于脂类代谢。脂质代谢的失衡会导致炎症反应，这与哮喘的发病机制密切相关。神经酰胺是一类结构相似的物质，由神经鞘氨醇、长链碱基和可变链脂肪酸组成。神经酰胺是鞘磷脂代谢的核心和必不可少的第二信号分子，在炎症刺激后可进一步放大炎症反应，诱导细胞凋亡，造成组织损伤。以往的研究表明，在OVA诱导的哮喘小鼠肺组织中，C24:1、C24:0、C16:0等多种不同酰基链长的神经酰胺种类明显增多。抑制肺组织中神经酰胺的产生可以减少呼吸道炎症，但将神经酰胺输送到呼吸道可能会导致气道炎症、重塑和气流阻塞。一些研究还表明，神经酰胺水平的升高可能导致细胞凋亡、活性氧（ROS）的产生和中性粒细胞的浸润。支气管肺泡灌洗液（BALF）中神经酰胺的升高与中性粒细胞肺部炎症、哮喘严重程度和糖皮质激素抵抗显著相关。神经酰胺可作为监测药物治疗哮喘疗效和改善哮喘临床症状的生物标志物。

LysoPCs是一种溶血磷脂，由磷脂酶A2（PLA2）将磷脂酰胆碱水解而成。已证实，LysoPC对天然免疫系统有很大的影响，尤其是由花生四烯酸链位置组成的LysoPC（0：0/20：4），是一种强大的炎症介质。LysoPC可以通过刺激Toll样受体（TLRs）和G蛋白偶联受体（GPCRs）并介导ROS的产生来激活转录因子NF-κB，从而诱导炎症反应。此外，LysoPC还可激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），促进炎症因子的增殖和分化，促进炎症的发生，这与哮喘的发病机制密切相关。因此，SMD可能通过调节脂质代谢发挥哮喘炎症作用。

在蛋白质组学研究中，通过TMT化学标记技术分析肺组织中的DEPs，以探讨SMD的抗哮喘机制。总共筛选了84个DEPs。基于这些DEPs，GO功能注释主要涉及NADPH氧化酶，KEGG通路分析主要集中再溶酶体。在84个DEPs中，Napsa、Ctsh、Ctss、Ctsb、Lgmn、Lipa、Arsb、Ppt1、Ncf1、Ncf2、Ncf4和Cybb蛋白在建模后表达量显着增加，SMD可以下调这些蛋白的表达量。Napsa、Ctsh、Ctss、Ctsb、Lgmn、Lipa、Arsb和Ppt1蛋白属于溶酶体水解酶。溶酶体是细胞质中必需的细胞器，含有多种水解酶，如蛋白酶、脂肪酶、硫酸酶等，可以分解多种生物分子。在某些情况下，溶酶体的损伤可能导致溶酶体水解酶释放到细胞质中，从而引发细胞的应激反应，包括NF-κB的激活、炎症和细胞死亡。在这项研究中，模型组溶酶体水解酶表达水平的增加被SMD治疗下调。我们推测SMD通过减少溶酶体水解酶的释放并进一步抑制NF-κB的激活，进而减轻哮喘气道炎症。

Ncf1、Ncf2、Ncf4和Cybb是NADPH氧化酶复合体的组成部分。活化的NADPH氧化酶复合体聚集在吞噬小体中并产生ROS。NADPH氧化酶及其过量产物ROS介导的氧化应激可引起气道炎症反应、气道高反应性、气道微血管通透性、气道粘液高分泌、组织损伤和组织形态改变，最终导致哮喘的病理生理变化。值得注意的是，NF-κB活性对这种氧化应激和炎症反应至关重要。研究表明，ROS通过激活氧化还原敏感的NF-κB在肺内启动炎症反应，导致气道重塑和促炎介质的反射，例如肿瘤坏死因子-α、IL-1β和IL-6。此外，在炎症过程中，尤其是在免疫细胞中，NF-κB可以激活吞噬细胞中NADPH氧化酶的表达。因此，ROS可以与NF-κB信号通路相互作用。核因子-κB影响细胞内ROS的产生，反过来，核因子-κB的活性水平也受ROS水平的调节。我们的研究结果表明，SMD可能通过减轻ROS诱导的氧化应激和抑制NADPH氧化酶激活的炎症而发挥抗炎和抗氧化作用。

代谢组学数据表明，神经鞘脂代谢的代谢标志物主要是神经酰胺，甘油磷脂代谢的代谢标志物主要是LysoPCs。神经酰胺可导致ROS的产生，而LysoPCs通过刺激TLRs和介导ROS的产生而激活转录因子NF-κB，从而诱导炎症反应。蛋白质组学分析表明，SMD可降低溶酶体水解酶的表达，抑制NADPH氧化酶活性及其过量产物ROS介导的氧化应激。溶酶体水解酶可激发核因子-κB的启动，导致炎症和细胞死亡。NADPH氧化酶和ROS介导的氧化应激可与NF-κB信号通路相互作用。

代谢组学和蛋白质组学分析均表明，SMD的抗哮喘机制与NF-κB信号通路密切相关。核因子-κB是一种转录因子，也是炎症反应中的关键调节因子，据报道在哮喘的发生中起重要作用。激活的NF-κB可诱导气道炎症、免疫细胞活化和气道重塑。通过抑制NF-κB的兴奋可以改善哮喘的病理变化。NF-κB被认为是治疗哮喘的潜在靶点。因此，本研究对MyD88/IKK/NF-κB信号通路中的蛋白表达水平进行了分析。结果显示，SMD可降低模型组中MyD88、IKK（α）、NF-κB（p65）、P–NF-κB（p65）、IκBα和P-IĸBα的表达水平。因此，SMD可能通过调节MyD88/IKK/NF-κB信号通路使NF-κB失活，从而减少炎症因子的释放，改善气道炎症和重塑，最终达到治疗哮喘的目的。

在本研究中，我们只研究了SMD的抗炎作用，但从组学数据中获得了大量的信息，这为我们从不同的角度考虑SMD的抗哮喘作用提供了更多的参考。因此，我们将在未来的实验中进行更多的研究，例如检测大鼠肺中NADPH氧化酶活性、ROS水平和溶酶体损伤的变化，以验证蛋白质组预测。据报道，OVA诱导的小鼠由于激活了NF-κB并将其移位到细胞核，导致核内NF-κB蛋白表达增加，胞浆中表达减少。因此，肺组织中NF-κB在胞核和胞浆中的表达水平有待于进一步研究。此外，化学药物和SMD的联合应用将是哮喘治疗相关研究的另一个有趣的方面，因此我们将进行实验，以分析地塞米松和SMD联合治疗哮喘的效果。

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0378874123015209?via%3Dihub

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