FSHW | 蜂王浆主蛋白调节小鼠机体免疫功能与肠道菌群

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Introduction

蜂王浆（RJ）是由工蜂的咽下腺和下颌腺分泌的、含有丰富营养成分的半透明乳脂状物质，专供蜂王（女王）终生食用，它决定着蜜蜂的级型分化，它决定雌性蜜蜂幼虫是否能够发育成为蜂王。幼虫期只能吃到3 d蜂王浆的雌性蜜蜂只能发育为寿命只有1～2个月、无生育能力的工蜂，而蜂王个体大、每天能产2000粒左右、重量超过蜂王体重的卵，寿命长达5～6年。大量研究报道显示，蜂王浆对哺乳动物人体具有许多生物活性，比如抗氧化、抗菌、抗癌、抗炎、抗衰老、稳定血压等特性。过去一直认为王浆酸（10-羟基-2-癸烯酸）是蜂王浆的关键活性成分，近20多年来国内外研究证实，蜂王浆主蛋白（MRJPs）是蜂王浆的关键活性成分。在鲜王浆中水溶性MRJPs约占12%-15%。MRJPs属于同一个由9个成员（MRJP1-9）组成、同源性很高的家族。MRJPs作为小蜜蜂食物的蜂王浆中决定蜜蜂雌性幼蜂发育为蜂王还是工蜂的关键因子。

浙江大学浙江大学生物系统工程与食品科学学院食品科学与营养系食品科学专业沈立荣教授团队前期研究表明，MRJPs具有多种生物活性，如延长果蝇寿命；促进未成熟雌性小鼠和更年期卵泡发育、促进雌激素分泌；促进雄性小鼠睾丸管增粗，增强精子活力；增强老年大鼠的空间记忆力；可替代60%牛血清培养多种动物和人体细胞。经过近20年的科技攻关，沈立荣教授团队已经实现了高纯度MRJPs蛋白冻干粉（图1）产业化，并作为可常温保存、性质稳定的一类新型蛋白资源和功能食品应用，目前已应用于卵巢早衰引起的妇女不孕不育、妇女更年期综合症临床研究，改变传统蜂王浆产品需要靠冰冻保存才能确保蛋白生物活性的局面。

此外，最近一项研究表明，服用蜂王浆可以表现出抗抑郁的作用。然而，目前关于MRJPs在调节机体免疫功能及肠道菌群的影响却鲜有报道。

在上述研究的基础上，河南大学淮河医院转化医学中心硕士研究生吴航、副教授王军朋联合浙江大学浙江大学生物系统工程与食品科学学院教授沈立荣等在本研究中，利用从蜂王浆中分离的MRJPs冻干粉，并研究了膳食补充MRJPs冻干粉对小鼠机体的免疫细胞的数量及功能和肠道菌群的影响。该研究通过酶联免疫吸附试验检测了免疫细胞的数量、免疫细胞增殖及分泌细胞因子的能力，最后通过16s DNA技术评价了MRJPs对小鼠肠道内菌群的影响，以此证明MRJPs作为膳食补充剂在调节机体免疫功能及肠道菌群的影响。

Results and Discussion

细胞增殖是免疫细胞的重要生理功能之一，也是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。而淋巴细胞的增殖直接影响机体的免疫防御，进而影响宿主的健康状态。本研究采用酶联免疫吸附试验，对饲喂MRJPs的小鼠体内淋巴细胞增殖情况进行测定，结果如图1A-C所示，250 mg/kg（M250）和500 mg/kg（M500）的MRJPs可促进ConA、抗CD3/CD28和脂多糖（LPS）诱导的脾细胞增殖，而125 mg/kg（M125）的MRJPs则无此作用。然而，对于肠系膜淋巴细胞来说，不同剂量的MRJPs并不改变由有丝分裂原触发的细胞增殖（图1D-F）。这说明，饮食中的MRJPs最先在脾细胞而不是肠系膜淋巴细胞中引起内毒素诱导的B细胞增殖。

细胞因子是由多种组织细胞所合成及分泌的小分子多肽或糖蛋白。它们能介导细胞间的相互作用，具有多种生物学功能，如调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等。此研究发现，与对照组相比，当ConA或抗CD3/CD28抗体激活脾脏T细胞时，给予250或500 mg/kg MRJPs的小鼠产生更多IL-2（表1）。同时，M250或M500处理的小鼠在T细胞有丝分裂原刺激的脾细胞中产生的IFN-γ和IL-17A显著低于对照组。此外，用抗CD3/CD28激活的脾细胞在四组中产生的IL-4水平没有差异（表1）。而在对照组和M125组之间，本研究没有检测到细胞因子产生的任何变化。

表1 MRJPs对有丝分裂原刺激的脾细胞和肠系膜淋巴细胞产生细胞因子的影响

雌激素是由雄激素转化而产生的一种G18类固醇激素，在芳香酶的催化下能够影响生殖系统。雌激素主要通过与雌激素受体结合起作用。之前有研究表明，雌激素可能是免疫反应中的一个敏感因素，由此通过测定雌激素的水平，可以反映出蜂王浆对小鼠免疫功能的影响。在接受MRJPs处理四周后评估小鼠的血液雌激素水平，并确定这种处理对激素水平的影响。M125、M250和M500组小鼠血清雌激素水平分别为（10.6±2.80）、（13.64±3.09）和（6.54±0.43）pg/mL，分别比对照组（5.22±0.34）pg/mL高103%、161%和25%。而增加的雌激素水平与免疫细胞分泌的细胞因子水平存在显著的负相关（图2），这些研究表明体内机体免疫细胞功能的改变或许与膳食MRJPs上调雌激素水平改变有直接的关系。

胃肠道微生物群落代表了人体微生物的最高密度和总量，微生物区系生活在几乎每一个它们可以接触到的宿主表面。过去10年来，几项关于肠道微生物学和免疫学之间关系的研究证明，动物与其定植的细菌种群之间的动态相互作用有助于免疫系统的功能和发展。为了确定MRJPs是否会影响肠道微生物区系组成，本研究对饲喂不含MRJPs或添加250 mg/kg MRJPs的小鼠的粪便和盲肠内容物进行了16S rRNA基因测序。此研究在所有24个样本中确定了高质量的读数。这些读数被聚为56671个ASV，而25833个（45.6%）和19104个（33.7%）ASV分别是粪便和盲肠内容物所独有的（图3A）。在粪便样本中，7640例（20.3%）ASV在MRJPs和对照组之间共享，而15625例（41.6%）和14302例（38.1%）ASV分别是MRJPs和对照组所独有的（图3B）。而在盲肠内容物中，4866个ASV（15.8%）在MRJPs和对照组之间共享，11674个（37.9%）和14298个ASV（46.3%）分别是MRJPs和对照组所独有的（图3C）。在门水平上，厚壁菌属和拟杆菌属在粪便和盲肠内容物中占主导地位；拟杆菌在粪便中含量较丰富，而厚壁菌在盲肠内容物中较丰富（图3D）。在属水平上，异杆菌和乳酸杆菌在粪便和盲肠内容物中占主导地位；异杆菌在粪便中较丰富，乳酸杆菌在盲肠内容物中较丰富（图3E）。结果表明补充MRJPs对肠道菌群无明显影响，即MRJPs不会破坏肠道环境的平衡。

稀疏曲线反映了测序深度对观测样本多样性的影响。如图4A所示，随着测序数量的增加，可能会发现新的微生物组类型。对Chao1、Faith_pd、Goods_coverage、Observed_spectes四个指数的样本内α-多样性分析表明，两组（FRJ和CRJ）之间的粪便差异显著（图4B）。在ASV水平，主成分分析表明，MRJPs组在粪便和盲肠样本中的肠道微生物组成与对照组没有实质性差异（图4C）。

另外，此研究还分别在门和属的水平上比较了MRJPs组和对照组中前10名微生物的组成。Lefse被用来识别在样本分类中表现出显著差异的物种或群落，并确定组间生物标记物的差异。研究结果表明，普氏杆菌、副杆菌科和芽孢杆菌是MRJPs处理组的粪便中显著的生物标志物，肠杆菌属、丙型变形菌、念珠菌和志贺氏菌是MRJPs处理组盲肠内容物中的显著生物标志物（图5）。其他微生物显示出的差异可以忽略不计，除了MRJPs处理组盲肠内容物中的软壁菌门丰度相当低，这表明MRJPs对肠道微生物区系的影响很小。

Conclusion

因此，此研究发现补充蜂王浆的主要蛋白成分MRJPs可调节宿主免疫局部及全身的免疫细胞的免疫功能和激素水平，并有助于保持肠道微生物群的稳定性。因此，MRJPs可作为调节宿主机体免疫细胞的功能及改善机体性激素水平的一种功能性食物蛋白的来源。重要的是，该研究提示MRJPs或许将来用于预防或治疗慢性炎症性疾病或免疫细胞介导的自身免疫性疾病的临床。

第一作者

吴航，河南大学淮河医院转化医学中心，硕士研究生。研究方向为营养免疫以及胃肠道肿瘤的临床与基础研究。目前共发表学术论文10 篇，其中SCI论文5 篇，中文期刊论文5 篇，获2021年河南医学科技奖一等奖。

通信作者

王军朋，副教授，硕士生导师，河南省教育厅学术带头人。现任职于河南大学淮河医院转化医学中心，主要从事营养免疫与慢性炎性疾病的防治研究。目前主持和参与科研项目10余项，其中主持国家自然基金和河南省自然科学基金各2项。迄今为止，在Critical Reviews in Food Science and Nutrition，Journal of Nutrition, Journal of Nutritional Biochemistry等杂志发表学术论文50余篇。先后在美国塔夫茨大学完成博士后研究工作及作为Scientist III从事营养免疫方面的研究工作，期间荣获美国TUFTS大学人类营养衰老研究中心麦N.哈密博士后卓越奖。荣获河南省教育厅科技进步奖贰等奖及河南省医学科技奖贰等奖各1 项。现为International Immunopharmacology编委和PloS One 学术编委。

Major royal-jelly proteins intake modulates immune functions and gut microbiota in mice

Hang Wua, Shican Zhoua, Wenjuan Ninga, Xiao Wua, Xiaoxiao Xua, Zejin Liua, Wenhua Liua, Kun Liub, Lirong Shenc, Junpeng Wanga,*

a Infection and Immunity Institute and Translational Medical Center of Huaihe Hospital, Henan University, Kaifeng 475000, China

b College of Biology Science and Engineering, Hebei University of Economics and Business, Shijiazhuang 050061, China

c College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang Key Laboratory for Agro-Food Processing, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

*Corresponding author.

Abstract

In this study, we investigated the effects of major royal jelly proteins (MRJPs) on the estrogen, gut microbiota, and immunological responses in mice. Mice given 250 or 500 mg/kg, not 125 mg/kg of MRJPs, enhanced the proliferation of splenocytes in response to mitogens. The splenocytes and mesenteric lymphocytes activated by T-cell mitogens (ConA and anti-CD3/CD28 antibodies) released high levels of IL-2 but low levels of IFN-γ and IL-17A. The release of IL-4 was unaffected by MRJPs. Additionally, splenocytes and mesenteric lymphocytes activated by LPS were prevented by MRJPs at the same dose as that required for producing IL-1β and IL-6, two pro-inflammatory cytokines. The production of IL-1β, IL-6, and IFN-γ was negatively associated with estrogen levels, which were higher in the MRJP-treated animals than in the control group. Analysis of the gut microbiota revealed that feeding mice 250 mg/kg of MRJPs maintained the stability of the natural intestinal microflora of mice. Additionally, the LEfSe analysis identified biomarkers in the MRJP-treated mice, including Prevotella, Bacillales, Enterobacteriales, Gammaproteobacteria, Candidatus_Arthromitus, and Shigella. Our results showed that MRJPs are important components of royal jelly that modulate host immunity and hormone levels and help maintain gut microbiota stability.

Reference:

WU H, ZHOU S C, NING W J, et al. Major royal-jelly proteins intake modulates immune functions and gut microbiota in mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(1): 444-453. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250038.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片来源：图虫创意