if9+南大医学院附属口腔医院：牙周炎唾液菌群通过肠道菌群加剧结肠炎诱导的焦虑样行为

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导读

肠-脑轴是肠道和中枢神经系统之间的双向通信系统。许多与宿主相关因子，如口腔细菌，会影响肠道菌群，从而通过肠脑轴使大脑成为易感目标。唾液中含有大量口腔细菌，牙周炎作为一种常见的口腔疾病，会改变唾液菌群的组成。然而，牙周炎唾液菌群（PSM）在肠-脑轴上的作用和机制仍不清楚。本研究利用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠焦虑样行为研究其本质和机制。与健康的唾液菌群相比，PSM恶化了焦虑样行为，显著减少了DSS小鼠正常神经元的数量并激活小胶质细胞。抗生素处理消除了PSM对焦虑样行为的影响，而移植PSM灌胃小鼠的粪便菌群则加剧了焦虑样行为。这些结果表明，PSM的焦虑加剧作用取决于肠道菌群。此外，在无DSS诱导的小鼠中，未发现PSM对焦虑样行为的影响，这表明DSS处理是PSM加剧焦虑的前提条件。机制上，PSM改变了肠和脑代谢组学中的组氨酸代谢。补充组氨酸相关代谢物与PSM具有相似的焦虑加剧作用，这表明组氨酸代谢可能是这一过程中的关键途径。本研究结果表明，PSM可通过直接影响宿主肠道菌群而加剧结肠炎诱导的焦虑样行为，强调了口腔疾病在肠-脑轴中的重要性。

论文ID

原名：Periodontitis salivary microbiota exacerbates colitis-induced anxiety-like behavior via gut microbiota

译名：牙周炎唾液菌群通过肠道菌群加剧结肠炎诱导的焦虑样行为

期刊：npj Biofilms and Microbiomes

IF：9.2

发表时间：2023.12

通讯作者：李艳芬，闫福华

通讯作者单位：南京大学医学院附属口腔医院

实验设计

实验结果

1.牙周炎唾液菌群在DSS小鼠中加剧了焦虑样行为

唾液菌群收集自19个志愿者，包括9名牙周炎患者和10名健康人。基于Bray-Curtis的主坐标分析（PCoA）显示，牙周炎唾液菌群（PSM）与健康唾液菌群（HSM）之间存在差异（图1a）。PSM的α-多样性显著高于HSM（图1b）。在门水平上，PSM中厚壁菌门相对丰度低于HSM（图1c）。在科水平上，与HSM相比，PSM中链球菌科的相对丰度降低，而紫单胞菌科升高（图1d）。根据线性判别分析效应大小（LEfSe）分析（LDA > 2），在科水平上，而紫单胞菌科和螺旋体科是PSM中的主要特征菌，而链球菌科是HSM中的主要特征菌（图1e）。微生物组组成（ANCOM）分析表明，PSM中上调的螺旋体科和互养菌科以及HSM中上调的链球菌科是两组中的显著差异菌（补充图1a）。这些结果表明，PSM与HSM具有显著差异，PSM的主要特征细菌是紫单胞菌科和螺旋体科，HSM的主要特征细菌是链球菌科（补充图1b）。作者将混合唾液菌群灌胃至24只小鼠中，并使用DSS成功诱导了结肠炎（图1f）。与之前结果一致，与HSM（H-DSS组）相比，PSM（P-DSS组）会加剧DSS诱导的结肠炎，包括结肠长度缩短、组织学评分增加和肠道屏障损伤（补充图1c-g）。

为了观察唾液菌群对焦虑样行为的影响，本研究进行了基于旷场、明暗箱和高架十字迷宫的行为测试。在旷场中，DSS组在边缘区域的时间更多，较少时间在中心区域，速度慢于CON组。与H-DSS组相比，P-DSS组在边缘区域的时间更长，速度更慢（图1g，h）。在明暗箱中，DSS组的穿梭次数明显低于CON组。与H-DSS组相比，P-DSS组在明箱中的时间以及在明箱和暗箱之间穿梭的次数都明显更低（图1i）。在高架十字迷宫试验中，DSS组小鼠的开臂活动时间和进入开放臂的次数均低于CON组，P-DSS组小鼠的开臂活动时间也少于H-DSS组（图1j）。上述结果表明，DSS加剧焦虑样行为，而PSM加剧DSS诱导的焦虑样行为。然而，在DSS处理前，PSM灌胃小鼠和HSM灌胃小鼠的行为变化并无显著差异，这表明DSS处理是这种行为加剧的重要前提条件（补充图2a-d）。

图1 牙周炎唾液菌群加剧DSS小鼠的焦虑样行为

a，健康唾液菌群（HSM）和牙周炎唾液菌群（PSM）的主坐标分析（Bray-Curtis；HSM：n=10，PSM：n=9）；b，HSM和PSM的α-多样性（香农指数和观察到的物种），每个箱线图代表中位数、四分位距、最小值和最大值（Wilcoxon）；c，HSM组和PSM组的肠道菌群在门水平的组成；d，HSM组和PSM组肠道菌群在科水平的组成；e，根据LEfSe分析，HSM组（蓝色）和PSM组（红色）中具有区分性的生物标志物；f，示意图和研究设计，详细描述见方法部分的研究1（每组n=6）；g，代表性的旷场轨迹图；h，旷场中，在边缘区域的时间、在边缘区域的速度和进入中心区的次数；i，在明箱中的时间和明暗箱穿梭的次数；j，高架十字迷宫中，小鼠在开放臂中的时间和进入开放臂的次数。统计分析采用Tukey检验的普通单因素方差分析。结果以平均值±标准差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

2.肠道菌群介导了PSM加剧DSS诱发的焦虑样行为

先前的研究表明，PSM会导致肠道菌群紊乱，而肠道菌群会影响神经精神疾病。因此，作者假设受PSM影响的肠道菌群在加剧DSS诱导的焦虑样行为中起着关键作用。为了研究被唾液菌群改变的肠道菌群对焦虑样行为的影响，作者使用抗生素处理来消除不同组间对抗生素敏感的肠道菌群差异。唾液菌群灌胃后，对DSS小鼠用抗生素处理1周（图2a）。在旷场中，ABX组（抗生素处理）、H-ABX组（HSM灌胃+抗生素处理）和P-ABX组（PSM灌胃+抗生素处理）之间在边缘区的活动时间和速度以及进入中心区的时间均无明显差异（图2b，c）。抗生素处理后，各组之间的明暗箱和高架十字迷宫结果也无显著差异（图2d，e）。这些结果表明，抗生素处理消除了两组之间的行为差异，表明肠道菌群是PSM加剧焦虑样行为的关键因素。

为了进一步验证肠道菌群在焦虑样行为中的作用，作者移植了唾液菌群灌胃小鼠的新鲜粪便菌群，并进行DSS处理以观察行为变化（图2f）。与H-FMT组（移植HSM灌胃小鼠粪便）相比，P-FMT组（移植PSM灌胃小鼠粪便）的DSS小鼠在旷场边缘区域的时间明显更长，在旷场边缘区域的速度和进入中心区的次数也有所降低，但差异并不显著（图2g，h）。与H-FMT组相比，P-FMT组在明光下的时间、在明暗箱之间穿梭的次数、开臂活动时间和进入开放臂的次数都明显减少（图2i，j）。值得注意的是，与P-FMT组和FMT组相比，H-DSS组在明暗箱之间穿梭的次数显著增加（图2i）。这些行为结果表明，P-FMT组与PSM组具有类似的焦虑样加剧效应，证实了PSM通过肠道菌群加剧了DSS诱导的焦虑样行为。此外，在无DSS小鼠中也观察到了焦虑样行为。DSS处理前，H-ABX组和P-ABX组之间在旷场、明暗箱和高架十字迷宫中无显著差异（补充图3a-e），H-FMT组和P-FMT组之间也无显著差异（补充图3f-j），这表明DSS处理是PSM对焦虑影响的前提条件。

图2 肠道菌群是牙周炎的关键，唾液菌群加剧葡聚糖硫酸钠诱导的焦虑样行为

a，研究2的实验设计，详细描述见方法部分（每组n=6）；b，抗生素处理后的代表性旷场轨迹图；c，旷场中，在边缘区域的时间、在边缘区域的速度和进入中心区域的次数；d，在明箱中的时间和明暗箱穿梭的次数；e，高架十字迷宫中，小鼠在开放臂中的时间和进入开放臂的次数；f，粪菌移植的示意图和研究设计，粪便菌群来自研究1，细节见方法部分（每组n=6）；g，粪菌移植的代表性旷场轨迹图；h，旷场中，在边缘区的时间、小鼠进入中心区的频率以及在边缘区的速度；i，在明箱中的时间以及明暗箱穿梭的次数；j，高架十字迷宫中，小鼠在开放臂的时间和进入开放臂的次数。统计分析采用Tukey检验的普通单因素方差分析。结果以平均值±标准差表示。*p < 0.05，**p < 0.01。

3. PSM通过肠道菌群损害神经元并激活大脑皮层的小胶质细胞

然后，作者探讨了PSM影响焦虑样行为过程中与焦虑相关的病理变化，包括免疫荧光检测小胶质细胞的形态和Nissl染色检测正常神经元的数量。Nissl染色结果显示，与H-DSS组相比，P-DSS组大脑皮层中正常神经元的数量明显减少，表现为神经元细胞质凝固、形状不规则和染色加深（黑色箭头；图3a）。离子钙结合适配器分子1（Iba1）是小胶质细胞标志物，结果显示，与H-DSS组相比，P-DSS组大脑皮层中的小胶质细胞明显皱缩，表明小胶质细胞被激活（图3b）。然而，CON组、DSS组、H-DSS组和P-DSS组在海马体齿状回（DG）和CA区（Cornu Ammonis）的神经元形态未观察到明显变化（补充图4a，b）。各组间海马体DG和CA区的小胶质细胞改变也无明显差异（补充图5a、b）。上述结果表明，PSM改变了大脑皮层的脑病理学。

为了确定肠道菌群在脑病理学变化中的作用，作者检测了抗生素处理组和粪菌移植组小鼠的小胶质细胞和神经元。在抗生素处理小鼠中，H-ABX组和P-ABX组在神经元数量和小胶质细胞活化中无显著差异（图3c，d）。与PSM的影响类似，粪菌移植实验结果显示，与H-FMT组相比，P-FMT组大脑皮层神经元的数量和小胶质细胞的活化显著减少（图3e，f）。因此，PSM可以通过肠道菌群减少正常神经元的数量并激活小胶质细胞，从而加剧焦虑样行为。

图3 牙周炎唾液菌群通过肠道菌群减少神经元数量并激活大脑皮层小胶质细胞

a，CON、DSS、H-DSS和P-DSS组中的代表性Nissl染色图和神经元数量，比例尺=150 μm；b，CON、DSS、H-DSS和P-DSS组中小胶质细胞的代表性Iba1（红色）和DAPI（蓝色）染色图，比例尺=50 μm；c，抗生素处理后，H-ABX组和P-ABX组的代表性Nissl染色图和神经元数量，比例尺=150 μm；d，H-ABX组和P-ABX组中小胶质细胞的代表性Iba1（红色）和DAPI（蓝色）染色图，比例尺=50 μm；e，粪菌移植后的代表性Nissl染色图和神经元数量，比例尺=150 μm；f，粪菌移植实验中，小胶质细胞的代表性Iba1（红色）和DAPI（蓝色）染色图，比例尺=50 μm。统计分析采用Tukey检验的普通单因素方差分析（a，e）和双尾t检验（c）。结果以平均值±标准差表示。*p < 0.05，***p < 0.001。每组n=6；正常神经元计数时，每组6只小鼠，每只小鼠选取同一部位的3个视图进行计数。

4. PSM改变了DSS小鼠肠道菌群的组成

16S基因测序法检测H-DSS组和P-DSS组的肠道菌群组成，以研究肠道菌群的变化。与H-DSS组相比，P-DSS组的α-多样性有所下降（图4a）。PCoA显示，两组的肠道菌群组成存在显著差异（图4b）。在门水平上，P-DSS组中厚壁菌门的相对丰度低于H-DSS组（图4c）。在科水平上，P-DSS组中肠杆菌科和拟杆菌科的相对丰度高于H-DSS组（图4d）。LEfSe分析表明，P-DSS组的特征菌群为肠杆菌科，而H-DSS组的特征菌群为厚壁菌门，以及Muribaculacae科和普雷沃氏菌科（图4e）。随机森林分析的结果预测，肠杆菌科和克里斯滕森菌科可能是P-DSS组中的重要细菌群（图4f）。ANCOM的结果显示，P-DSS组中上调的奇异菌科、肠杆菌科和Erysipelatoclostridiaceae，以及H-DSS组中上调的丁酸弧菌科是两组之间差异最显著的菌群（补充图6a）。因此，肠杆菌科可能是P-DSS组的主要致病菌。此外，奇异菌科、Muribaculacae和拟杆菌科在H-DSS组和P-DSS组之间具有显著差异（补充图6b）。克雷伯氏菌和肠杆菌是肠杆菌科的主要菌种，作者使用PCR检测其表达，发现克雷伯氏菌在P-DSS组中显著上调（补充图6c）。最后，基于未观测状态重建的群落系统发育研究（PICRUSt2）-标记基因序列的功能预测显示，H-DSS组和P-DSS组肠道菌群的主要功能途径富集于代谢相关途径，包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢、辅助因子和维生素的代谢（图4g）。遗传信息处理主要富集于复制和修复，而细胞过程则主要富集于细胞迁移。这表明，PSM导致肠道菌群紊乱，可能与氨基酸和碳水化合物代谢中的代谢物变化有关。

图4 牙周炎唾液菌群改变了肠道菌群的组成

a，H-DSS组和P-DSS组的α-多样性（香农指数，观察到的物种），每个箱线图代表中位数、四分位距、最小值和最大值（Wilcoxon，每组n=6）；b，H-DSS组和P-DSS组的主坐标分析（Bray-Curtis）；c，H-DSS组和P-DSS组中肠道菌群在门水平上的组成；d，H-DSS组和P-DSS组中肠道菌群在科水平上的组成；e，LEfSe分析显示的H-DSS组（蓝色）和P-DSS组（红色）中具有区分性的标志物；f，基于随机森林分析的重要微生物；g，根据PICRUSt2对H-DSS组和P-DSS组肠道菌群的功能预测。

5. PSM对DSS小鼠肠道代谢物的变化

本研究中，作者用液相色谱-质谱法探究了肠道代谢物的变化，分别对正离子和负离子模式下筛选的代谢物进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），结果显示，P-DSS组和H-DSS组的肠道代谢物之间存在显著差异（图5a）。作者对代谢物进行Z-score分析以观察其相对含量，13-OxoCOE、N-乙酰-L-组氨酸（NAH）、氨基酸（arg-）、尿嘧啶-5-羧酸和3-脱氢鞘氨醇是P-DSS组中含量最高的前五种代谢物，大黄素、烟酰胺、3-吲哚甲酸、环喷托酯和左旋多巴是H-DSS组中含量最高的前五种代谢物（图5b）。差异代谢物的富集分析表明，氨基酸代谢（组氨酸代谢和精氨酸生物合成）和神经递质相关途径（可卡因成瘾、谷氨酸能突触和γ-氨基丁酸能突触）是主要途径，其中组氨酸代谢差异明显（图5c）。斯皮尔曼相关分析用于确定代谢物之间的相关性，NAH和氨基酸（arg-）与其它代谢物成显著负相关性，表明可能起着重要作用（图5d）。最后，作者构建了这些代谢物及其途径的网络。根据该网络，氨基酸代谢（如组氨酸、精氨酸和脯氨酸）是大多数代谢物参与的途径，其中L-谷氨酸和L-谷氨酰胺是关键点，而NAH是这些代谢物中唯一一个在P-DSS组被高度表达的代谢物（图5e）。值得注意的是，一些肠道代谢物和相关途径，如γ-氨基丁酸能突触和左旋多巴（在H-DSS组中含量高），是参与焦虑样行为的神经递质。因此，作者推测这些代谢物，特别是组氨酸代谢和NAH，是PSM导致焦虑样行为恶化的关键。

图5 灌胃牙周炎唾液菌群后肠道代谢物的变化

a，正离子和负离子模式的OPLS-DA得分图（每组n=5）；b，Z-score分析显示P-DSS组和H-DSS组中代谢物的表达情况；c，P-DSS组和H-DSS组中差异代谢物的斯皮尔曼相关性分析；d，P-DSS组和H-DSS组中肠道代谢物的富集分析，横轴表示途径影响；e，差异代谢物及其途径的网络图，蓝点代表途径，其大小表示该途径所含代谢物的数量，其它颜色的点代表代谢物，其颜色表示P-DSS组相对于H-DSS组的log2(FC)值。

6. PSM导致DSS处理小鼠的大脑代谢异常

作者进一步研究了大脑代谢，以探索影响焦虑样行为的关键代谢物。正负离子模式的OPLS-DA分析结果显示，H-DSS组和P-DSS组的代谢物之间存在显著差异（图6a）。这些代谢物的富集分析表明，磷脂酰乙醇胺生物合成、组氨酸代谢、嘌呤代谢、肉碱合成、鞘脂代谢和天冬氨酸代谢是主要富集途径（图6b）。此外，神经元相关途径，如磷脂酰乙醇胺生物合成、磷脂酰胆碱生物合成和鞘脂代谢也是富集途径。差异代谢物的表达如图6c所示。主要的差异代谢物在P-DSS组中高度表达；因此，作者对P-DSS组中的上调代谢物进行富集分析，结果显示，嘌呤代谢、肉碱合成、苹果酸-天门冬氨酸穿梭、组氨酸代谢和葡萄糖-丙氨酸循环是前五大富集途径（图6d）。组氨酸代谢物富含于肠道内容物和大脑中，因此，组胺相关代谢物被重点分析。H-DSS组和P-DSS组中的组胺H1受体（H1R）表达被检测，结果显示P-DSS组的大脑皮层中H1R的表达相对较高，这表明组氨酸代谢物在大脑中起着关键作用（补充图5c）。N-甲基咪唑和N-乙酰-L-组氨酸在P-DSS组的脑代谢中高度表达（图6e），而后者同时也在P-DSS组的肠道代谢中高度表达（图6f）。本研究建立脑代谢物、肠道代谢物和肠道菌群的斯皮尔曼相关性分析网络（P < 0.05），以进一步探讨肠道菌群与代谢物之间的关系。结果显示，拟杆菌科与肠道代谢物（包括NAH和左旋多巴）密切相关，而只有肠杆菌科与脑代谢物相关，这表明肠杆菌科在肠-脑轴中发挥重要作用（补充图6d；相关性和p值见补充表1）。这些结果表明，肠道菌群与大脑和肠道代谢相关，组胺相关代谢物是PSM影响焦虑样行为的关键介质。

图6 牙周炎唾液菌群导致大脑代谢变化

a，正离子和负离子模式的OPLS-DA评分图（每组n=5）；b，代谢物富集分析散点图，点代表路径，横轴为路径影响，纵轴为log(p)值；c，P-DSS组和H-DSS组脑代谢中差异代谢物表达的热图；d，P-DSS组和H-DSS组中脑代谢物的富集分析；e，大脑中组胺相关代谢物的表达；f，肠道中N-乙酰-L-组氨酸的表达。统计分析采用双尾t检验。

7. N-乙酰-L-组氨酸可能是PSM通过肠-脑轴促进焦虑的介质

为了验证肠道代谢物的作用，作者首先使用P-DSS组肠道中高度表达的组胺相关物质NAH来刺激小胶质细胞。结果显示，NAH可以增加小鼠BV-2小胶质细胞中CD86+/CD206-的表达，而加入NAH后，CD206+/CD86-的表达下降，特别是在1 nM浓度时（图7a，b）。接着，本研究使用10 nM的NAH灌胃DSS小鼠和无DSS小鼠（图7c）。在NAH作用下，小鼠的结肠长度显著缩短，结肠炎的组织学评分增加，表明NAH加剧了DSS小鼠的结肠炎，但在无DSS处理时，NAH没有破坏肠道屏障（补充图7a-e）。行为水平上，NAH显著增加了DSS处理小鼠在边缘区的时间，并降低了其进入旷场中心区的次数（DSS+NAH组vs. DSS组；图7d，e）。同样，与DSS组相比，DSS+NAH组的穿梭次数（图7f）和在开放臂中的时间更少，进入开放臂的次数更低（图7g）。组织学上，Nissl染色显示，NAH灌胃减少了DSS小鼠中正常神经元的数量（图7h）。免疫荧光显示，NAH激活了小胶质细胞，且在DSS+NAH组最为明显（图7i）。然而，无DSS小鼠在NAH作用下，基于旷场、高架十字迷宫和明暗箱的焦虑样行为和正常神经元数量没有明显改变，表明DSS诱导的肠道破坏是NAH加剧焦虑样行为的必要条件。这些发现表明，肠道代谢物（如NAH）是PSM促进DSS小鼠焦虑样行为的关键物质。

图7 N-乙酰-L-组氨酸可能是PSM通过肠-脑轴促进焦虑的介质

a，BV-2细胞中CD86和CD206表达的代表性流式细胞仪图；b，N-乙酰-L-组氨酸浓度为0、0.01、0.1和1 nM时，BV-2细胞CD86+CD206-与/CD86-CD206+的比率（n=4）；c，研究4的实验设计，详细描述见方法部分；d，N-乙酰-L-组氨酸处理后的代表性旷场轨迹图（每组n=6）；e，旷场中，小鼠在边缘区的时间、进入中心区的次数以及在边缘区的速度；f，在明箱中的时间以及明暗箱穿梭次数；g，高架十字迷宫中，小鼠在开放臂的时间和进入开放臂的次数；h，N-乙酰-L-组氨酸处理实验中，代表性Nissl染色图和神经元数量，比例尺=150 μm（正常神经元计数时，每组6只小鼠，每只小鼠选择同一部位的3个视图进行计数）；i，N-乙酰-L-组氨酸处理实验中，小胶质细胞的代表性iba1（红色）和DAPI（蓝色）染色图，比例尺=50 μm。统计分析采用Tukey检验的单因素方差分析（b），以及双尾t检验（e-h）。结果以平均值±标准差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

近年来，口腔-肠道轴的作用受到越来越多的关注。牙周炎会影响神经精神行为和肠道菌群；然而，其确切机制仍有待阐明。本研究发现PSM通过肠道菌群及其衍生代谢产物加剧了DSS诱导的焦虑样行为。组胺相关代谢产物可能是加剧焦虑样行为的主要物质，而小胶质细胞激活和神经元减少可能是相关机制。本研究表明，牙周炎会通过唾液影响肠道菌群，从而改变焦虑样行为，这为PSM影响肠脑-轴提供了证据。

口腔和肠道是两个直接相连的重要细菌储存地。唾液是这两个细菌储存地共享的介质，含有许多在肠道中发现的口腔细菌。这些口腔细菌会导致肠道屏障功能受损和肠道菌群紊乱。因此，牙周炎可通过吞咽细菌，以及通过血液循环运输至体内的炎症因子来影响全身状况。口腔致病反应性的辅助性T细胞17可被口腔细菌激活，并迁移到肠道，加重结肠炎。本研究结果表明，PSM可加剧DSS诱导的焦虑样行为。混合唾液菌群可反映宿主的真实状况，但唾液菌群如何影响中枢神经系统功能仍值得研究。大量研究表明，牙周致病菌（如牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌）会导致中枢神经系统异常和神经精神疾病。牙龈卟啉单胞菌通过诱导突触衰竭增加软脑膜细胞中IL-1的产生。在阿尔茨海默病病变中，牙龈卟啉单胞菌还可以通过荚膜多糖和囊泡发挥作用。一项对大鼠第二臼齿进行丝线结扎，并感染具核梭杆菌株ATCC 25586的研究发现，大鼠的认知能力异常和脑部病变进一步加重。虽然这些细菌的致病机制并不完全相同，但它们都会引起大脑甚至全身的一系列免疫反应，这表明单一的牙周炎-致病共生菌就能导致神经精神疾病的发生。因此，是否是唾液中的特定致病菌，或混合菌群的组合，抑或是增加的细菌含量，在唾液促进疾病发展的问题仍有待探讨。此外，由于细菌天然存在于人类唾液中，因此还应考虑HSM的作用。值得注意的是，HSM的特点是含有链球菌科，而唾液链球菌的减少会加重肠道炎症。然而，本研究发现，与对照组相比，除了在明暗转换中的转换频率外，HSM并不影响焦虑样行为，这表明影响焦虑样行为的关键因素是PSM，而不是HSM。因此，唾液在健康人中的作用仍有待探索。

以往的研究表明，肠道菌群是多种神经精神疾病的关键因素，包括情绪、运动和认知功能。双侧嗅球切除小鼠会出现慢性抑郁和焦虑样行为，伴随着肠道微生物特征的改变。无菌小鼠在移植肠易激综合征患者的粪便后，会出现胃肠道转运加快、肠道屏障功能障碍和焦虑样行为。相反，改善肠道菌群组成则能改善抑郁和焦虑。虽然抗生素能改变肠道菌群组成，但也会清除对抗生素敏感的肠道菌群。抗生素会改变行为，但这种影响会在两周内恢复到基线，且这些变化与炎症活动、胃肠道神经递质或迷走神经无关，表明抗生素通过肠道菌群影响中枢神经系统功能。本研究表明，抗生素处理后两组之间的行为差异消失了，这表明对抗生素敏感的肠道菌群可能是PSM加剧焦虑样行为的主要因素。此外，益生菌能改善情绪和睡眠质量，从而可能有益于心理健康。因此，肠道菌群变化与神经精神疾病直接相关。在本研究中，肠杆菌科是灌胃PSM小鼠体内最主要的科水平类群，并且与脑代谢物相关。已有研究表明，属于肠杆菌科的克雷伯氏菌是影响IBD（炎症性肠病）的关键细菌。肠杆菌科大量存在于患有IBD和抑郁症病人的粪便中，且数量要多于有IBD但没有抑郁症的病人。单独或混合灌胃肠杆菌科、克雷伯氏菌和大肠杆菌导致无菌小鼠和无特定病原体小鼠出现结肠炎和类似抑郁症的行为。这些革兰氏阴性菌可能会通过其副产品（如脂多糖和外多糖）改变全身炎症和中枢神经系统功能。然而，这些菌群对神经精神疾病发展的影响还需要进一步研究。

肠道菌群衍生的代谢物可能是导致神经精神疾病的一个重要因素。肠道菌群可以合成或消耗多种传统的神经递质，如多巴胺、血清素和γ-氨基丁酸。来自肠道衍生的代谢物可穿过血脑屏障，影响中枢神经系统的活动。肠道中的细菌可将酪氨酸转化为4-乙基苯酚硫酸盐（4EPS），4EPS可穿过血脑屏障，降低大脑中形成髓鞘的神经少突胶质细胞的成熟度，从而导致焦虑。一项含有30名患有自闭症和胃肠道疾病的儿童的临床试验显示，受试者在口服药物AB-2004后，血液和尿液中的代谢谱发生改变，包括4EPS水平降低、胃肠道健康改善和焦虑减少。组胺也可能是影响焦虑和肠道菌群失调引起的免疫反应的一种关键代谢物。组胺通过组胺受体参与中枢神经系统的多个生理过程。神经元和星形胶质细胞中的H1R可调节焦虑样行为，抑制组胺受体可能是治疗焦虑症的有效方法。NAH是组胺代谢的标志物，可能与过敏反应有关。在本研究中，NAH也促进了DSS小鼠的焦虑样反应。先前的研究表明，益生菌鼠李糖乳杄菌株LGG的干预可增加拟杆菌属的数量并降低NAH的丰度，这表明改善肠道菌群可减少此类不良代谢物产生。然而，组织损伤也会产生组胺，而NAH致病菌或PSM的增加也会加剧结肠炎；因此，肠道菌群通过产生不良代谢物还是加剧结肠炎来发挥作用，仍有待阐明。

大脑中的非神经元细胞，如小胶质细胞和星形胶质细胞，对于提供代谢支持、调节神经递质、调节突触可塑性以及直接调节小鼠的焦虑样行为至关重要。小胶质细胞是大脑中主要的先天性免疫细胞，是神经元活动和微生物衍生分子的感应器。中枢神经系统组织收到信号后，小胶质细胞会被激活，改变其形态、吞噬能力和极化状态。在许多精神疾病中，过度激活这些细胞会产生过多的炎症介质和扩大组织损伤。选择性敲除Ucp2会改变小胶质细胞的活性氧生成、吞噬能力和突触数量，这表明小胶质细胞和神经元之间的相互作用参与了大脑功能的控制。酒精活性激酶Src通过增加肿瘤坏死因子的产生来激活小胶质细胞，从而引起焦虑，这表明代谢会影响神经元和小胶质细胞。本研究表明，PSM及其引起的代谢物NAH能激活小胶质细胞并破坏皮质神经元。鞘磷脂代谢紊乱会导致严重的神经元损伤和神经退行性疾病。这些神经元相关通路在本研究中被富集，这表明PSM有可能对神经元产生影响。皮层和海马都参与了焦虑，但皮层区域的病理变化更明显，这可能是因为组胺及其相关神经元与皮层的关系更为密切。海马区是一种焦虑受体，与焦虑的相关性目前已被广泛研究。海马区在PSM影响焦虑样行为中的作用值得进一步探讨。

值得注意的是，无DSS小鼠的焦虑样行为未见明显变化，而NAH仅使DSS小鼠的焦虑样行为恶化，这表明牙周炎促进焦虑的先决条件可能是DSS导致的肠屏障功能障碍。然而，本研究的局限性在于其短期效应，长期处理的结果尚未确定。一些研究也表明，牙周炎或PSM的长期影响会破坏肠道屏障功能。除了肠道屏障受损外，牙周炎还会导致全身炎症，而慢性炎症与精神症状和神经系统疾病有关。长期的牙周炎还可能导致神经精神疾病，包括焦虑、神经创伤和压力相关疾病。研究者提出，牙周炎可能会影响焦虑，尽管其发表的系统综述中存在一些争议，这可能与研究时间的长短和纳入的研究类型有关。因此，探讨长期的PSM吞咽对肠道的影响非常重要。

综上，本研究结果表明，PSM可通过肠道菌群和代谢紊乱加剧DSS诱导的小鼠焦虑样行为，这表明牙周炎唾液菌群是影响肠-脑轴的一个因素。这些发现为牙周炎在胃肠道和神经精神疾病中的重要作用提供了新的见解。

https://doi.org/10.1038/s41522-023-00462-9

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