【文献速递】金黄色葡萄球菌生物膜中SCCmec介导的甲氧西林耐药性自发转移

BRICS

编译：麻颖颖审核：陈盼

背 景

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是一种革兰阳性菌，约30%人口的鼻腔中存在这种细菌，其携带者通常无症状。然而，一旦发生机会性感染，轻则皮肤脓肿，重则导致肺炎、骨髓炎甚至中毒性休克综合征。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus ，MRSA) 凭借其复杂的毒力因子和耐药基因，已经成为了医院感染的重要病原菌。这些基因许多位于可移动遗传元件上，如质粒、噬菌体、转座子、致病性岛、插入序列和葡萄球菌盒式染色体（staphylococcal cassette chromosome，Scc）等，这给金黄色葡萄球菌通过水平基因转移(horizontal gene transfer，HGT)发生进化提供了条件。金黄色葡萄球菌的水平转移机制主要分为噬菌体转导和自然转化。金黄色葡萄球菌的亚群可通过Sigma因子SigH转录调控转化能力，其直接调控可以编码促进DNA靠近转化通道的假菌毛的comG操纵子和编码DNA内化通道的comE操纵子。

SCCmec是一个20-60kb的遗传元件，含有甲氧西林耐药决定因子mecA基因，赋予MRSA的β-内酰胺类抗生素耐药性。在CS2培养基中，经修饰的金黄色葡萄球菌N315衍生菌株中SigH过表达，有助于以接触依赖的方式吸收SCCmec-II元件，但细胞-细胞间的SCCmec转移机制不清,且未经修饰的模型菌株（N315或N315ex）和其他临床分离株中检测不到转化效率。

图片概要：

研究结果

01

双组分系统（Two-component regulatory system,TCS）调控comG操纵子在亚群中的表达

为了阐明自然转化的条件，在S. aureus菌株N315ex w/o 19(简称为Nef，不具有任何接合元件/溶原性噬菌体，不能转移DNA，缺少SCCmec和TCS2)中构建15个TCS敲除株Δ3 -Δ17。comG操纵子启动子PcomG先前已被用于监测sigH依赖性和S. aureus感受状态相关的基因表达。为了验证PcomG报告基因是否适合监测和感受机制基因的表达，将PcomG-gfp和PcomE-dsRed双荧光报告质粒引入Nef。与亲本菌株相比，在CS2培养基中培养的ΔTCS突变体中报告基因表达的峰值每OD的GFP荧光强度，Δ12菌株中PcomG-gfp的表达量增加了约2.5倍，Δ13菌株中PcomG-gfp的表达量显著降低了约4倍，而Δ17菌株中PcomG-gfp的表达完全被消除。此外，用荧光显微镜观察各菌株表达GFP报告基因的细胞群比例，其中亲本菌株约有11.3%的细胞表达，Δ13和Δ17分别只有2.9%和0.1%的细胞表达，Δ12中占比高达49.3%，相应的回补株将GFP的表达水平恢复到野生型水平。综上，TCS12、TCS13以及最重要的TCS17参与了Nef自然能力的调节，其中TCS13和TCS17激活PcomG，TCS12抑制PcomG(图1)。

图1、TCS12、TCS13和TCS17调控comG启动子活性及机制

02

靶向细胞壁的抗生素和生物膜生长条件调节comG表达

由于comG的表达也受到环境影响，为检测PcomG-gfp在生物膜生长条件下的表达情况，在CS2培养基中静态培养Nef及其衍生菌株，以sigH-null突变体(ΔH)作为阴性对照，Nef -过表达的SigH作为阳性对照 (Nef-H，5’-UTR修饰的pRIT-sigH质粒，可缓解对SigH的翻译抑制)，1天后超过90%的细胞表达了GFP（图2a）。在Nef-GFP报告菌株中，表达gfp的细胞百分比持续增加，并在第3天达到峰值(图2a)，这一效应在Δ13和Δ17菌株中受损。

图2、在CS2静态 (生物膜)生长条件下，TCS13和TCS17对PcomG活性和自然转化至关重要

03

生物膜的生长条件提高了自然转化效率

为了检测在生物膜条件下生长的细胞中的转化体，采用热杀伤的细胞(N315Δcls2-tetR或NefΔcls2-tetR)作供体，在浮游生长条件下(未检测到，<10−11,n = 5)未检测到转化体(图2c，右)；而在生物膜形成条件下，Nef在第3天的转化频率达到10−6~7，且Nef- H的转化频率和Nef相似，ΔH是不可转化的(图2c，左)。这表明， SigH表达是在生物膜中转化的必要因素，但不是限制因素。

该研究进一步检测了杆菌肽、万古霉素，乳酸链球菌素对生物膜生长条件下细菌转化效率的影响：低浓度杆菌肽(0.5μmL−1)处理降低转化效率，高浓度（5 μmL−1）抑制转化(图2d，左)。此外，万古霉素处理对该菌株的自然转化没有显著影响(图2d，中)。

04

SCCmecA元件可以在生物膜中通过自然转化转移

研究者使用MSSA临床分离株作为受体，热杀伤MRSA或耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌菌株(MR-CoNS)作为供体，通过在生物膜中自然转化来检测mecA的转移。用头孢美唑选择mecA转化子，发现这些MSSA受体可被染色体四环素耐药基因转化。

图3、不同SCCmec元件在生物膜生长条件下的种内和种间转化

05

确认SCCmec在转化子中的获得和稳定性

和其他类型转化子相比，35s转化子含有mecA基因，并且头孢类药物(头孢美唑和头孢西丁)的最低抑制浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)升高（图4a）。头孢西丁耐药稳定性测试表明，在不含β-内酰胺的情况下，35s和98s突变体持续耐药(图4b)，这一结果也通过纸片扩散得到证实：稳定转化菌35s（con15）对头孢西丁和邻苯西林的敏感性降低。上述结果表明，SCCmec元件可以通过生物膜的自然转化转移到MSSA菌株中，且SCCmec类型和受体菌株是转化子中SCCmec稳定性的驱动因素

图4、SCCmec的转化

06

SCCmec转化依赖于CcrAB重组酶基因和完整的attB位点

SCCmec元件携带盒式染色体重组酶（cassette chromosome recombinase，Ccr）基因，负责编码特定的切除和整合系统。为了确定SCCmec转化是否由CcrAB介导，研究者从SCCmec-II元件(N315ΔccrAB)中删除了ccrAB基因，N315ΔccrAB作为供体无法获得SCCmec转化子，而其亲本菌株N315可以作为SCCmec供体(图3a)，说明CcrAB介导的SCCmec位点特异性切除/整合对于转化的产生至关重要。在受体层面构建了attB序列的突变(NefattB*)，该突变体不能产生SCCmec转化体(图3)。因此，SCCmec转化依赖于CcrAB重组酶基因和完整的attB位点。

图5、SCC转化依赖CcrAB–attB系统

总结

summary

本研究发现金黄色葡萄球菌的SCCmec元件可以在生物膜中进行自然转化，强调了生物膜在促进HGT以及转导和结合方面的额外作用，揭示了MRSA形成过程的机制。在未来，有望通过控制生物膜的形成来对抗SCC系统介导的葡萄球菌的进化。

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