肿瘤树突状细胞内鞘脂激活蛋白原的高糖基化驱动免疫逃逸​

撰文｜风

免疫系统的功能之一是免疫监视。控制甚至清除肿瘤细胞需要强有力的免疫应答。目前，我们认为树突状细胞（dendritic cell，DC）将肿瘤抗原提呈或交叉提呈给抗原特异性的CD4+和CD8+T淋巴细胞，经活化、增殖和分化后产生效应性CD4+和CD8+T淋巴细胞，CD8+T淋巴细胞迁移至肿瘤部位识别并杀伤肿瘤细胞【1】。DC的抗原交叉提呈可以分为胞质途径（cytosolic pathway）和液泡途径（vacuolar pathway）两种【2, 3】，前者摄入的抗原从内体进入胞质，经蛋白酶体降解后进入内质网或内体/溶酶体加载MHC-I分子；后者摄入的抗原在内体/溶酶体内经组织蛋白酶直接降解后加载MHC-I分子。有效的抗原提呈和功能性效应T细胞对抗肿瘤免疫反应至关重要。然而，肿瘤细胞进化出多种机制逃脱免疫攻击，包括降低MHC-I类分子表达和分泌免疫抑制性细胞因子等【4, 5】。因此，如何恢复抗肿瘤免疫应答是目前肿瘤免疫的热点。

鞘脂激活蛋白原（Prosaposin，pSAP）是鞘脂激活蛋白（saposin）的前体蛋白，在sortilin的辅助下从高尔基体迁移至溶酶体，经组织蛋白酶（cathepsins）水解后，生成saposin A，B，C，D四种蛋白【6】。一方面，saposin作为溶酶体酶的激活因子，参与鞘脂的水解代谢。另一方面，在内体溶酶体区室酸性条件下，saposin可以结合溶酶体内囊泡上的阴离子磷脂，如磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）等，其膜扰乱功能可以促进囊泡崩解【7】。值得注意的是，肿瘤细胞由于不可控的生长，产生大量的死亡细胞和凋亡小体，内含大量可以触发免疫应答的肿瘤抗原【8】。而凋亡小体的特征就是磷脂双分子层的PS【8】。因此，DC能否由此摄入肿瘤细胞的凋亡小体并基于液泡途径交叉提呈抗原值得深入研究。而saposin能否在这个过程中如何发挥作用也不清楚。

近日，美国哈佛医学院附属波士顿儿童医院的Florian Winau研究团队在Science杂志在线发表题为Hyperglycosylation of prosaposin in tumor dendritic cells drives immune escape的研究文章。该研究指出pSAP在DC膜相关抗原的交叉提呈中的重要作用以及肿瘤内TGF-β驱动pSAP高糖基化导致抗原加工提呈能力受损介导的免疫逃避机制，并提供有效的增强抗肿瘤免疫应答新策略。

作者首先通过γ射线辐照MCA纤维肉瘤细胞引起凋亡，收集上清后经超速离心获得凋亡小体。凋亡小体加载钙黄绿素后与重组saposin孵育，结果发现相比于BSA对照组，saposin可以显著增强凋亡小体中钙黄绿素的泄露，尤以saposin D最为明显。不仅如此，saposin也可以促进凋亡小体中小分子蛋白的释放。免疫荧光染色显示saposin主要分布在DC的溶酶体内，同时摄入的凋亡小体也定位在溶酶体。虽然saposin并不影响DC的早期内吞，但是在晚期，saposin敲除的DC内有更多的凋亡小体，提示saposin有助于凋亡小体的加工。之后，DC-CD4/CD8淋巴细胞共培养实验证实saposin不影响可溶性抗原的抗原提呈，但是，对于膜相关抗原的抗原提呈是至关重要的。因此，这些数据提示saposin参与降解凋亡小体，并辅助膜相关抗原对CD4+T和CD8+T淋巴细胞的抗原提呈。

接着，作者在体内验证saposin的功能。作者将CFSE标记的OVA特异的CD8+T淋巴细胞过继入pSAP KO和WT小鼠体内，并皮下给于凋亡的MCA-OVA细胞进行免疫。四天后，分离皮肤引流淋巴结中DC发现KO组DC的H-2Kb-SIINFEKL的表达显著降低，CD8+T淋巴细胞的增殖和IFN-γ表达也在KO组明显降低，提示pSAP KO小鼠的抗原交叉提呈能力受损。由于pSAP敲除影响小鼠寿命，作者通过骨髓移植构建嵌合子小鼠后给于凋亡的MCA-OVA细胞进行免疫，1周后正常MCA-OVA细胞皮下瘤造模。结果发现pSAP敲除的骨髓重塑小鼠肿瘤明显大于对照组，且肿瘤DC的H-2Kb-SIINFEKL的表达显著降低，OVA特异性的CD8+T淋巴细胞在数量和功能上均受损。与此同时，骨髓重塑小鼠不经凋亡小体免疫而直接给于MCA-OVA皮下瘤也得到相似的结果。另外，作者排除了pSAP对于DC迁移和巨噬细胞的影响。总之，这些数据表明pSAP对于肿瘤免疫应答的重要性。作者之后从人黑色素瘤组织中流式分选CD146+黑色素瘤细胞，CD11b/c+髓系细胞和CD8+ T细胞，并在体外培养中加入重组saposin，验证saposin在人肿瘤免疫应答中的作用。结果显示saposin同样在人DC的抗原提呈中有重要作用。

接着，为了研究病理条件下肿瘤DC中pSAP的调节行为，作者流式分选MCA-OVA皮下瘤造模小鼠肿瘤，引流淋巴结和脾脏中的cDC1（XCR+/CD103+）和cDC2（SIRP1α+/CD11b+）。FITC-Dextran吞噬实验表明肿瘤，淋巴结和脾脏的DC吞噬能力无差异；DQ-OVA抗原加工和H-2Kb-SIINFEKL流式染色实验证实肿瘤cDC2的可溶性抗原处理和提呈能力减弱；而肿瘤cDC和cDC2对于膜颗粒抗原的处理和提呈能力受损。有意思的是，WB显示脾脏DC的pSAP主要在65Kda（pSAP65），而肿瘤DC的pSAP则主要分布在75kDa（pSAP75），且单分子saposin含量在肿瘤DC中也显著降低，培养上清中则出现大量pSAP，提示肿瘤DC中pSAP大量分泌至细胞外。为了证实pSAP分子量的改变是由于糖基化修饰，作者使用内切糖苷酶H切割实验（Endo H）证实pSAP75存在复杂聚糖。质谱进一步证明pSAP65主要包含甘露糖残疾，而pSAP75除了甘露糖外还存在N-乙酰葡萄糖胺，半乳糖和唾液酸。qRT-PCR结果显示肿瘤DC上调数个复杂糖苷转移酶，如N-乙酰葡萄糖胺转移酶，甘露糖转移酶和唾液酸转移酶。前已述及，pSAP在sortilin辅助下从高尔基体迁移至溶酶体，作者使用临近连接技术（proximity ligation assay，PLA）证实肿瘤DC中pSAP和sortilin结合受损，IP进一步佐证这一点。总之，这些数据提示肿瘤DC中的pSAP经历高糖基化后不能与sortilin结合，而直接被分泌到细胞外，导致降低的saposin不能参与抗原交叉提成。

为何肿瘤DC中pSAP会发生高糖基化？作者在体外筛查可能涉及的细胞因子，发现TGF-β造成pSAP的高糖基化和分泌，但不影响sortilin的表达。DC特异性敲除TGF-β受体TGF-β receptor II（Tgfbr2）小鼠在缺少TGF-β信号后，产生更好的DC介导的抗肿瘤免疫应答。之后，作者发现TGF-β上调Mgat4a, Mgat5, 和B4galt1，进而直接参与pSAP高糖基化。机制上，CHIP实验表明TGF-β下游的Smad2/3可以直接结合Mgat4a, Mgat5, 和B4galt1的promoter区。

最后，为了将上述结论应用于肿瘤治疗，作者将pSAP连接到内吞受体DEC205抗体（anti-DEC205）上构建pSAP-抗体复合物。在体外，添加pSAP-anti-DEC205复合物可以恢复pSAP KO DC的抗原交叉提呈能力和相应CD8+T淋巴细胞的活化。在体内，pSAP-anti-DEC205复合物可以显著降低pSAP KO骨髓重塑小鼠和WT小鼠的肿瘤，并增强抗肿瘤免疫应答。此外，pSAP-anti-DEC205也可以驱动抗肿瘤免疫记忆。值得注意的是，在冷肿瘤，如黑色素瘤，pSAP-anti-DEC205联合PD-L1抗体也可以显著增强肿瘤内效应CD4+和CD8+T淋巴细胞的浸润。总之，这些结果指出pSAP在肿瘤DC抗原提呈介导抗肿瘤免疫应答中的重要作用。

综上所述，这项研究阐释saposin在膜相关抗原加工和提呈并激活CD8+T淋巴细胞抗肿瘤免疫应答的关键作用以及肿瘤逃避免疫攻击的新机制，并提供一个可行的肿瘤免疫治疗策略。

https://doi.10.1126/science.adg1955

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