《食品科学》：山西大学蔡瑾副教授等：二氢槲皮素对大肠杆菌的抑菌作用机理

食用被大肠杆菌污染的食物往往会造成伤害，如群发性腹泻、呕吐等。食品防腐 剂主要分为两类，即化学防腐剂和天然防腐剂。天然防腐剂是从植物、动物和微生物中获得的具有抗菌和防腐活性的物质，安全性高且对环境友好。二氢槲皮素（DHQ），也称黄杉素、紫杉叶素、花旗松素，是一种从植物中提取出的二氢黄酮醇类化合物，有多项研究表明DHQ具有抑菌活性。

目前鲜见DHQ抑菌机理相关研究的报道，因此 山西大学应用化学研究所的蔡瑾、王梦亮和山西大学中医药现代研究中心的闫然等 测定了DHQ对常见食源性病菌的抑制活性，在确定大肠杆菌作为指示菌的基础上，观察大肠杆菌被DHQ作用后的形态变化，检测其胞内活性氧（ROS）水平、细胞受损伤程度、膜电位变化、胞内Ca2＋含量以及细胞周期变化，进而分析大肠杆菌受DHQ抑制的机理。

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DHQ对6 种食源性病菌的抑菌活性

图1结果表明DHQ对6 种食源性病菌的抑菌圈直径均在10 mm以上，均显著大于阴性对照的抑菌圈直径（P＜0.05），即DHQ对6 种食源性病菌均有显著的抑制效果（P＜0.05）。经ANOVA分析确定DHQ对6 种食源性病菌抑制作用强弱差异，结果表明DHQ对大肠杆菌有最佳的抑制作用（21.13 mm）（P＜0.05），对普通变形杆菌和热带假丝酵母菌的抑制作用次之（18.88、18.40 mm），对枯草芽孢杆菌以及产气肠杆菌的抑制作用较弱（14.67、13.90 mm），抑制金黄色葡萄球菌的作用最弱（12.35 mm）。

如表1所示，当DHQ对金黄色葡萄球菌和产气肠杆菌的处理质量浓度为0.02～1.25 mg/mL时，培养基呈现不同程度的浑浊现象；当处理质量浓度为2.5～20 mg/mL时，培养基清澈，没有病菌生长，因此质量浓度2.5 mg/mL被确定为DHQ对金黄色葡萄球菌和产气肠杆菌的MIC。当DHQ以0.020～0.625 mg/mL的质量浓度处理枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌和热带假丝酵母菌时，培养基表现出不同的浑浊度；当处理质量浓度为1.25～20.00 mg/mL时，培养基是清澈的，确定DHQ对枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌和热带假丝酵母菌的MIC为1.25 mg/mL。当DHQ对大肠杆菌的处理质量浓度为0.020～0.313 mg/mL时，培养基出现浑浊现象；当处理质量浓度为0.625～20.000 mg/mL时，没有病菌生长，确定0.625 mg/mL为DHQ对大肠杆菌的MIC。

结合抑菌圈直径和MIC检测结果，可以看出DHQ对大肠杆菌具有最强的抑制活性，因此选择大肠杆菌作为进一步研究DHQ抑菌机理的指示菌。

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DHQ对大肠杆菌细胞形态及结构的影响

SEM和TEM的结果能够直观地反映大肠杆菌被DHQ破坏的情况（图2）。对照组中大肠杆菌细胞表面光滑，呈现出规则的杆状结构（图2A-1、图2E-8）。经DHQ处理后，大肠杆菌的形态与对照组相比有明显不同（图2B～D、F～H）。图2B、F为由1/2 MIC的DHQ处理的大肠杆菌，虽然有些菌体细胞形态完好，但已经开始出现溶胀聚集现象（图2B-2），内容物溢出形成了空洞（图2F-9、10），有些细胞出现轻微的质壁分离现象（图2F-11）。经质量浓度为MIC的DHQ处理（图2C、G）后，细胞出现折叠黏连现象（图2C-3、4、5），亦有空泡结构（图2G-12），质壁分离明显（图2G-13）。大肠杆菌被2 MIC的DHQ处理后，亦有折叠现象（图2D-6），菌体结构出现明显的变形（图2H-14、15）、破裂（图2H-16）、降解（图2D-7）。DHQ的化学名为3,5,7,3’,4’-五羟基-2,3双氢黄酮醇，具有黄酮类化合物的基本结构。DHQ的多羟基位于其结构内部斥电子的大P-π共轭体系中，羟基中的氢原子容易脱离。因此，推测DHQ作用大肠杆菌后，羟基中的氢原子可能与细胞膜中的磷脂分子以氢键的形式相结合，使得膜结构变得疏松，导致膜通透性增加，出现菌体肿胀、质壁分离等现象。当DHQ的质量浓度进一步增加，菌体结构变形，并出现黏连破裂等现象。

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DHQ对大肠杆菌细胞内ROS水平的影响

由图3可知，与对照组荧光强度（36.65）相比，DHQ处理组的荧光强度分别增加到了41.14（1/2 MIC）、56.99（MIC）以及65.94（2 MIC）。经DHQ处理的大肠杆菌细胞的荧光强度显著高于阴性对照的荧光强度（P＜0.05）。ROS主要通过氧化呼吸链产生和累积。细菌的呼吸作用主要由细胞膜上相关的酶催化反应进行，因此细胞膜是细菌产生ROS的主要位点。经DHQ处理后，DCFH-DA探针的荧光强度显著增强，推测DHQ可以刺激胞内的ROS过度产生。细胞膜中的脂质会因为过多的ROS而过氧化，导致细胞膜的流动性降低。

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DHQ对大肠杆菌细胞膜通透性和完整性的影响

AnnexinV-FITC/PI双标记图显示4 种不同状态的细胞，左下（LL）、右下（LR）、右上（UR）、左上（UL）分别表示活细胞、受伤细胞、死细胞、坏死细胞与碎片。结合图4A～D可以看出，大肠杆菌在LL区的占比随着DHQ质量浓度的增加而逐渐减少，而LR区域大肠杆菌的占比增加。从图4E、F可以看出，与阴性对照相比，MIC和2 MIC DHQ处理后，正常的大肠杆菌占比显著下降（P＜0.05），受损细胞占比显著上升（P＜0.05）。由此推测，DHQ的处理可以使大肠杆菌细胞膜的通透性增加，完整性被破坏，从而影响细胞的正常生理活动，使活细胞减少。

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DHQ对大肠杆菌细胞膜电位的影响

如图5所示，阴性对照表现出较强的荧光强度，为68.97，随着DHQ质量浓度的增加，荧光强度逐渐降低，1/2 MIC、MIC、2 MIC DHQ处理后的大肠杆菌荧光强度分别为43.38、35.07、34.69。与阴性对照相比，DHQ处理后的大肠杆菌细胞荧光强度显著降低（P＜0.05）。以上结果表明，RH-123进入细胞内的动力减弱，即细胞膜内外电势差减少，由此可以推测出DHQ会引起大肠杆菌细胞膜去极化，使膜电位降低，进一步造成胞内离子紊乱，细胞的正常生理功能受到损伤。

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DHQ对大肠杆菌细胞内Ca2＋含量的影响

如图6所示，与对照组的荧光强度（44.31）相比，DHQ处理组的荧光强度减少到了33.13（1/2 MIC）、29.82（MIC）以及28.33（2 MIC）。大肠杆菌被DHQ处理后的荧光强度与阴性对照相比显著降低（P＜0.05）。在正常细胞中，胞内Ca2＋的含量处在稳定水平，当细胞膜通透性受损后，会导致Ca2＋的外漏。因此，胞内Ca2＋含量的变化可以反映出细胞膜通透性的变化。以上结果表明DHQ处理后的大肠杆菌胞内Ca2＋含量减少，推测DHQ可导致细胞膜损伤、Ca2＋外漏，并直接影响到由Ca2＋所参与的菌体的正常生长代谢和功能活动。

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DHQ对大肠杆菌细胞周期的影响

图7显示了DHQ处理后对大肠杆菌细胞周期的影响。经DHQ处理后，处于I期的大肠杆菌占比从82.99%（阴性对照）下降到了73.26%（1/2 MIC）、71.96%（MIC）、64.84%（2 MIC），处于R期的大肠杆菌占比从17.01%（阴性对照）上升到了26.74%（1/2 MIC）、28.04%（MIC）、35.16%（2 MIC）。DHQ处理后大肠杆菌处于I期的占比与对照组相比显著下降（P＜0.05），处于R期的占比显著上升（P＜0.05）。以上结果表明，DHQ对大肠杆菌的抑制作用与其干扰细胞周期有关。推测原因可能为DHQ损伤菌体的细胞膜，进入细胞内部，引起ROS在菌体内聚集，破坏了与DNA合成有关的酶或蛋白质，从而干扰了大肠杆菌正常的细胞周期。

结论

从植物中提取的DHQ可以抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌和热带假丝酵母菌的生长，其中对大肠杆菌的抑菌效果最好，所以选择大肠杆菌作为抑菌机理实验的指示菌。DHQ会使得菌体内ROS含量增加，细胞膜的完整性和通透性受到损坏，细胞严重变形，出现黏连、折叠等现象；细胞膜电位降低，发生去极化现象，造成胞内离子紊乱，导致Ca2＋等离子外漏，影响细胞生长代谢；使细胞周期滞留在R期，正常的细胞周期受到了干扰。本实验证实了DHQ对大肠杆菌等食源性病原菌具有显著抑制活性，并阐述了其抑菌机理。实验结果可为DHQ作为植物源食品防腐剂应用于食品安全领域提供理论参考。

本文《二氢槲皮素对大肠杆菌的抑菌作用机理》来源于《食品科学》2023年44卷第19期18-26页，作者：蔡瑾, 闫然, 王梦亮, 等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220512-148。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：美娟；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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