《食品科学》：哈尔滨工业大学王振宇教授等：食源性蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂的功能意义和结构-活性关系

2型糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病的主要发病机制是胰岛β细胞功能障碍和胰岛素靶组织（肝脏、脂肪和肌肉）胰岛素抵抗，在分子水平上表现为胰岛素与胰岛素受体（IR）结合后信号转导缺陷。酪氨酸磷酸化（pTyr）是开启和传导胰岛素信号的关键反应。细胞信号通路的精准和快速传播需要严格的调节机制以及灵活的调节方式。蛋白质磷酸化在细胞周期、生长、凋亡和信号传导等过程中起着重要调控作用。在体内，pTyr是动态可逆过程，是由特异性蛋白质酪氨酸激酶（PTKs）和蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTPs）平衡调控的。蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是一种在胰岛素靶向组织中普遍表达的细胞内非受体型PTPs，是PTPs超家族中的一员。自PTP1B被发现以来，它已成为治疗2型糖尿病的潜在靶点。因此，PTP1B抑制剂已被认为是治疗2型糖尿病的备选药物。

哈尔滨工业大学化工与化学学院的包美丽、王振宇*就PTP1B的结构、作用机制和食源性天然PTP1B抑制剂的相关研究进展进行了综述，以期为进一步开展PTP1B抑制剂的研究工作，开发新型PTP1B抑制剂和降糖功能食品提供参考。

1 PTP1B的结构生物学与作用机制

PTP1B是第一个从人胎盘中分离、纯化并鉴定的细胞内PTP，位于内质网（ER）的细胞质面，在人体组织中广泛表达。1994年，Barford等利用X射线晶体学阐明了PTP1B的晶体结构，它主要由435 个氨基酸组成，其抑制剂的作用位点主要有3 个（图1）。其中，N端结构域包含两个芳基磷酸酯结合位点，即高亲和力催化位点（A位点）和低亲和力非催化位点（B位点）。此外，第三个作用位点是距催化活性区域约20 Å处的C端变构位点。PTP1B的A位点是由8 个氨基酸残基（His214、Cys215、Ser216、Ala217、Gly218、Ile219、Gly220、Arg221）形成的刚性环状结构，被称为磷酸结合环——P环（P-loop），该位点中的亲核半胱氨酸残基Cys215在PTP1B催化过程中至关重要，是高度保守催化中心。通过化学修饰活性位点Cys215，PTP1B活性经历氧化或S-亚硝基化而失活。PTP1B的B位点是由Arg24、Arg254、Met258和Gln262等组成的非保守结合位点，对底物特异性识别具有重要作用，其中Arg24和Arg254与磷酸化底物间的相互作用至关重要。变构位点由一些独特的α-螺旋（α3、α6和α7等）组成，当PTP1B分子的C端结构域影响N端结构域时，PTP1B分子的整体构象发生变化，进一步使催化结构域与磷酸化底物之间直接接触，相互作用，PTP1B变构抑制剂通过切断他们之间的相互作用，使其不能呈现活性构象，从而使PTP1B失活。

2 PTP1B与2型糖尿病和肥胖症的关系

糖尿病是一种复杂的慢性全身性疾病，是十大导致人类死亡的疾病之一。糖尿病分为1型糖尿病、2型糖尿病、特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病。其中，2型糖尿病患者约占糖尿病患者的95%。人体长期保持高血糖状态会导致多器官损伤，并引起多种并发症。患者若没有得到及时有效的治疗，则会大大增加其患糖尿病肾病、神经性病变、视网膜病变和心脑血管疾病的风险。PTP1B作为2型糖尿病的潜在治疗靶点，不仅是胰岛素和瘦素信号通路的负调节因子，而且与ER应激和胰岛素分泌密切相关。

2.1 PTP1B对胰岛素和瘦素信号通路的负调节作用

2型糖尿病的关键诱因是胰岛素抵抗和β细胞功能障碍所导致的胰岛素绝对缺乏。IR与胰岛素结合后使IR催化结构域发生自磷酸化，引起IRS1和IRS2的多个酪氨酸残基磷酸化，进而激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和蛋白激酶B（PKB）/Akt通路，随后葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）转移至细胞表面，促进细胞的葡萄糖摄取。被激活的Akt还通过抑制糖原合成酶激酶3（GSK3）的活性来刺激糖原合成。PTP1B使磷酸化的IR和IRS1去磷酸化，致使IR失活并终止胰岛素信号（图2），抑制细胞对葡萄糖的摄取和糖原合成，导致胰岛素抵抗。PTP1B缺陷（PTP1B-/-）小鼠对胰岛素敏感性增强，肌肉和肝脏中IR的pTyr水平增加，这表明PTP1B是影响胰岛素信号通路非常重要的酶。

瘦素是一种分泌性蛋白类激素，主要由脂肪组织产生和分泌，以单体形式存在于血浆中。瘦素与瘦素受体结合后使Janus激酶2（JAK2）磷酸化，从而将信号传导至下游信号分子——信号传导与转录激活因子3（STAT3）来调节机体的物质和能量代谢。瘦素还能够刺激脂肪酸的氧化和胰岛素的释放。PTP1B使经瘦素活化的JAK2去磷酸化而失活，进而抑制瘦素信号转导。研究发现，对啮齿类动物施用瘦素后，IRS-PI3K通路被激活，这表明PI3K可能在胰岛素和瘦素信号通路之间起到了交互作用（图2）。因此，抑制PTP1B可能是减弱甚至逆转肥胖患者对胰岛素和瘦素抵抗的有效策略。

2.2 PTP1B与ER应激的关系

ER是负责将分泌蛋白和膜蛋白折叠、修饰和运输的细胞器。慢性高血糖和高脂血症则会破坏ER稳态，导致错误折叠或未折叠的蛋白堆积，进而产生ER应激。PTP1B位于ER膜上，与ER应激密切相关。用衣霉素或棕榈酸处理体外培养的成肌细胞C2C12，诱导使其产生ER应激，结果发现ER应激上调PTP1B的表达，使细胞对葡萄糖摄取减少。另一方面，PTP1B基因缺失可抑制ER应激，逆转衣霉素处理的小鼠肌细胞C2C12中葡萄糖摄取的下调；提高肝特异性PTP1B缺失（L-PTP1B -/- ）小鼠胰岛素敏感性，降低其脂质积累。因此，PTP1B有望成为由ER应激引起的胰岛素抵抗的有效治疗靶点。

2.3 PTP1B在胰岛β细胞中的作用

2型糖尿病的重要特征是胰岛素抵抗，即细胞对胰岛素的反应能力下降，外周组织对葡萄糖摄取和利用减少。PTP1B基因敲除小鼠的胰岛β细胞数量增多，凋亡率下降，葡萄糖刺激的胰岛素分泌增强，同时由链脲佐菌素诱导的β细胞缺失被部分逆转。此外，一项来自哈佛医学院Joslin糖尿病中心的报道显示，胰腺PTP1B缺陷的正常小鼠葡萄糖耐量无异常，而胰腺PTP1B缺陷的肥胖小鼠则表现出葡萄糖耐量受损，同时由葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少，在分子水平上还确定了酪氨酸蛋白激酶A5受体——EphA5是胰腺中一个潜在的PTP1B底物。这些结论为胰腺PTP1B在调节葡萄糖稳态方面提供了新的见解。综上，PTP1B的表达水平可能是影响胰腺β细胞功能的潜在因素。

3 食源性天然PTP1B抑制剂

食源性天然产物因其结构多样、种类繁多，对疾病靶点的作用机制也不尽相同。目前，通过分离纯化技术和活性跟踪法分离出的具有生物活性的天然产物已有几万种，主要包括酚类、萜类、皂苷和生物碱类化合物等。本节就食源性天然PTP1B抑制剂的化学结构与活性关系进行综述。

3.1 酚类化合物

酚类化合物的特征是至少具有1 个芳香环，并有1个或多个羟基与之相连。类黄酮是由15个碳组成的酚类化合物，是自然界中数量最多的天然产物，广泛存在于植物性食物中。秋葵中黄酮类化合物是其主要的成分之一。在一项对糖尿病大鼠进行连续8周灌胃秋葵提取物和槲皮素的研究中发现，秋葵提取物和槲皮素（酚类化合物1）可以通过抑制PTP1B和过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPAR-α）来调节糖尿病大鼠体内葡萄糖稳态和脂质稳态。甘草作为世界上最古老和最常见的草药之一，也是食品中的天然甜味剂和调味剂。有研究从甘草中分离出18 种黄酮类化合物，其中甘草黄酮B（酚类化合物2）对PTP1B的抑制活性较强，这可能与其结构中羟基或戊烯基的数目和位置有关，特别是环B上的戊烯基或异戊烯基可能会增强其抑制活性。另一项研究又从甘草的地上部分中分离出86 种酚类化合物，其中16种化合物在10 μmol/L浓度下对PTP1B的抑制率大于80%，其中化合物glycyuraln H、glycyuralin L、glycyuralin P（酚类化合物3～5）具有显著的PTP1B抑制活性，半抑制浓度（IC 50 ）分别为5.9、6.7 μmol/L和5.3 μmol/L，表明异戊烯基结构在抑制PTP1B活性中发挥着重要作用。黄牛木是一种富含多酚的植物，在我国被用作食物香料，其茶产品也广泛流传。研究发现从黄牛木中分离出的山酮类化合物——Cratoxanthone A（酚类化合物6）对PTP1B具有较强的竞争性抑制作用和时间依赖性抑制作用，其抑制机制是通过异构化酶复合物实现的。菊苣作为药食同源植物，其叶和根部都可食用，具有清热解毒和利尿消肿等功效。从菊苣中分离的2 种咖啡酰衍生物绿原酸（酚类化合物7）和菊苣酸（酚类化合物8）对PTP1B具有非竞争性抑制作用，是其变构抑制剂。通过分子对接模拟发现，绿原酸与PTP1B的关键残基Lys 197、Glu 200和Gln 288之间形成氢键相互作用，与其变构位点α7螺旋有效结合。而菊苣酸与PTP1B的残基Asn 193、Glu 276和Ile 281形成氢键相互作用，对PTP1B进行变构抑制。青钱柳在我国一直被用作传统滋补品，其叶被加工成茶产品。从青钱柳中分离出的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸（酚类化合物9）比杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸（酚类化合物10）对PTP1B有更强的抑制作用。浆果类水果因富含酚酸、类黄酮和花青素等活性物质而一直备受研究人员关注，美国农业部数据库还将浆果类食品确定为类黄酮的主要来源。在一项对浆果体外消化提取物进行PTP1B抑制活性的研究中发现，这些提取物富含花青素和其他酚类物质，且在一定浓度下均显示出PTP1B抑制活性。继续对其提取物中单体进行PTP1B抑制活性研究，发现锦葵色素-3-葡萄糖苷（酚类化合物11）对PTP1B的抑制作用最强，而花色苷和飞燕草苷对PTP1B没有抑制作用，这表明锦葵色素上葡萄糖基团的存在是导致PTP1B受到抑制的原因，类似于环B中甲氧基的影响，而羟基的存在可能不会促进花色苷对PTP1B的抑制活性；分子对接模拟结果显示，锦葵色素-3-葡萄糖苷与PTP1B的Tyr46、Asp48、Lys120、Asp181、Ser216、Gly220和Arg221残基形成氢键相互作用（图3），与Val49、Phe182和Ala217残基形成疏水作用力。蓝莓作为一种美味的浆果类食品备受大众喜爱。有学者以PTP1B抑制活性为指标，通过活性跟踪法共分离出6 种花青素，发现其中花青素-3-阿拉伯糖苷（酚类化合物12）对PTP1B的抑制活性最强，构效关系分析结果表明，花青素环B中的羟基数量在对PTP1B活性抑制中起着重要作用。酚类化合物1～12的结构如图4所示。

3.2 萜类化合物

萜类化合物是由甲戊二羟酸衍生，分子骨架以异戊二烯单元（C5单元）为基本结构单元的化合物及其衍生物，广泛存在于自然界中。五味子是我国著名的草药，同时也广泛用作食品补充剂。研究人员通过生物活性跟踪法从五味子石油醚提取物中分离出11 种化合物，其中包括4 种三萜类化合物、6 种木脂素和1 种酚酸，其中萜类化合物24-亚甲基环木菠萝烯酮（萜类化合物1）是首次从五味子中分离得到的，并且发现其对PTP1B具有显著的抑制作用。在我国，花楸是一种浆果类食品。研究显示，花楸乙醇提取物中6 种乌苏烷型和1 种羽扇豆烷型三萜具有显著的PTP1B抑制活性，其中，具有19α-羟基结构的乌苏烷型三萜化合物（pomolic acid-3β-acetate）（萜类化合物2）的抑制活性相对于化合物（3β-acetoxy-urs-12-ene-28-oic acid）（萜类化合物3）较低，而具有羽扇豆烷型三萜化合物（桦木酸）（萜类化合物4）对PTP1B的抑制活性最强，接近于阳性对照熊果酸（天然五环三萜类化合物）的抑制效果，它们仅在E环上具有不同的结构，正是这种结构差异导致了它们不同的抑制效果。山茱萸作为药食同源植物，含有多种活性物质，其中以熊果酸含量最为丰富，是山茱萸重要的质控指标。有学者基于糖尿病临床使用的中药提取物库，采用高通量筛选法确定了山茱萸果实中的熊果酸是PTP1B抑制剂，且是一种竞争性抑制剂。考虑到熊果酸的可用性和生物学特性，研究人员将熊果酸进行化学改性，合成了一系列熊果酸衍生物，其中合成得到的熊果酸衍生物UA0713（萜类化合物5）对PTP1B的抑制效果是熊果酸的10 倍，它在体外还能够刺激L6肌细胞中葡萄糖摄取，并通过增强IR磷酸化来促进CHO/hIR细胞中GLUT4的转运。萜类化合物1～5的结构如图5所示。

3.3 皂苷类化合物

皂苷是一类具有多种生物活性的类固醇或三萜类化合物，已广泛用于化妆品和制药行业。三七是一种中药，同时也是功能性食品。从三七中分离的新达马烷型三萜类化合物三七皂苷-LY（皂苷类化合物1）以及3 种已知化合物——20(R)-原人参二醇（皂苷类化合物2）、20(R)-人参皂苷-Rh2（皂苷类化合物3）、20(S)-人参皂苷-Mc（皂苷类化合物4）对PTP1B具有显著抑制活性，根据它们对PTP1B抑制活性的大小分析，具有原人参二醇型配基的化合物比具有3 种以上糖基的达玛烷三萜更有效，糖基部分的存在可能降低了化合物对PTP1B的抑制活性；而具有R构型的20(R)-人参皂苷-Rh2对PTP1B的抑制活性更强。皂苷类化合物1～4的结构如图6所示。

3.4 生物碱类化合物

生物碱是一种含氮有机化合物，参与植物体的防御功能。调料九里香还称为咖喱叶，广泛分布于东南亚地区，在印度作为调味食品。研究人员通过活性跟踪法从调料九里香氯仿提取相分离出4 种新的和14 种已知的咔唑生物碱，其中已知的生物碱mahanine（生物碱类化合物1）、mahanimbine（生物碱类化合物2）、8,8’-biskoenigine（生物碱类化合物3）对PTP1B具有显著的抑制作用。鱼腥草是《中华人民共和国药典》（2015版）中记载的一种重要的中药。有学者通过活性跟踪法从鱼腥草氯仿提取部位中分离出2 种新生物碱——哌内酰胺D的同系物（生物碱类化合物4）、4-羟基-1,2,3-三甲氧基-7H-二苯并喹啉-7-酮（生物碱类化合物5）以及2 种已知生物碱——7-氧代脱氢阿西米洛宾（生物碱类化合物6）和头花千金藤二酮B（生物碱类化合物7）。通过研究这些生物碱与PTP1B的构效关系发现，这些化合物含有3 个六原子环，其中1 个含氮五环或六环，这种结构可能在对PTP1B抑制活性中发挥了积极作用。生物碱类化合物1～7的结构如图7所示。

3.5 其他

除上述天然酚类、萜类、皂苷类化合物和生物碱外，食源性天然产物还有溴酚、香豆素和木脂素等，也具有PTP1B抑制活性。溴酚是海洋藻类食物中普遍存在的化学成分，其结构苯环中溴原子和溴酚衍生物的烷基链长度对PTP1B抑制起关键作用。

4 开发PTP1B抑制剂的挑战

尽管大量的研究表明，一些天然产物对PTP1B具有显著的抑制效果，其结构中的特定基团是抑制PTP1B的关键所在，但是这些PTP1B抑制剂作为临床药物制剂的开发仍然存在一些问题。一方面，PTP1B与其他PTPs的催化活性位点具有高度的同源性；另一方面，PTP1B中的催化结构域具有高极性特征，这导致大部分抑制剂对PTP1B的选择性不佳，且对细胞的通透性和生物利用度较低。因此，开发出精准抑制PTP1B的药物制剂是一项极具挑战性的任务。

4.1 PTP1B抑制剂的选择性

选择性是PTP1B抑制剂作为药物开发的主要问题之一。由于所有的PTPs的活性位点（即pTyr结合位点）都具有高度的结构保守性，阻碍了开发高亲和力和选择性PTP1B抑制剂的进程。然而，通过对PTPs底物特异性的研究发现，单独的pTyr部分不足以进行高亲和力结合，而pTyr两侧的残基对PTP1B底物识别具有重要作用，且其他的PTPs不具有与之相同的活性中心外围的作用位点。因此，PTP1B活性位点附近的子口袋也可以作为其抑制剂开发的目标，即开发出针对活性位点和独特的相邻外围位点的双配基抑制剂。例如，研究人员根据PTP1B活性位点的结构特征，合成出化合物Compound 2（图8），并分析其与PTP1B之间的相互作用机制。结果表明，不可水解的pTyr模拟物——膦(二氟甲基)-苯丙氨酸占据了活性位点，且远端4-膦二氟甲基苯基乙酰基与近端非催化位点Lys41、Arg47和Asp48残基形成了范德华力和离子间作用力。该研究结果显示，尽管PTP1B与Compound 2相互作用的氨基酸残基并不是PTP1B所独有的，但是所有与之相互作用的氨基酸残基组合都不同于其他PTPs的氨基酸残基。

4.2 PTP1B抑制剂的生物利用度

生物利用度是PTP1B抑制剂作为药物开发的另一重要问题。由于PTPs的活性位点在生理pH值下带有2个负电荷，而目前报道的以活性跟踪法获得的PTP1B抑制剂大多数都具有高带电性，这使得其在细胞中的渗透性降低，因此，研究人员针对这一问题提出了几种策略：其一，最直接有效的方法就是减少化合物的负电荷数量。 例如，研究人员合成的小分子肽类PTP1B抑制 剂——二羧酸类似物（图9A）因带有2 个负电荷而限制 了其对细胞的渗透性，当该化合物中的一个羧基被四唑 基所取代后形成邻四唑类似物（图9B），不仅保持了 其抑制活性的稳定性，还增加了其对细胞的渗透性和对 细胞的功能活性。 其二，因细胞膜的磷脂双分子层具有疏水性，药物通过细胞膜的过程可视为是在亲水和疏水介质之间的再分配，因此，可以通过增加化合物的疏水性，引入更多的疏水基团，使其变得更加亲脂，从而提高化合物的生物利用度。其三，由于PTP1B的变构位点与pTry结合 位点不同 ，其保守性较差、极性较弱，因此，开发靶向变构位点抑制剂是提高化 合物生 物利用度的一种替代策略。

5 结 语

全球糖尿病的患病率正逐年上升，若不能很好地控制2型糖尿病和肥胖症，患者会出现各种并发症。大量研究已经证明PTP1B抑制剂有望成为治疗2型糖尿病和肥胖症的候选药物，但目前还没有被美国食品药品管理局批准的临床使用的PTP1B抑制剂，究其原因可能是这些抑制剂对细胞膜渗透性低或选择性不佳，因此，设计PTP1B抑制剂药物成为了一项困难重重又极富挑战的任务。天然产物因具有结构多样、种类繁多、多靶点以及、多途径等优点，一直都是作为药物开发的主要原料，现阶段使用的药物约有一半是从天然产物中衍生而来，在生物化学研究以及药物创新领域发挥着重要作用。本文对食源性PTP1B抑制剂的构效关系以及作用机制进行了综述，发现多种食源性天然产物如酚类、萜类、皂苷类化合物和生物碱等对PTP1B具有显著的抑制活性，且大多数已发表的研究都集中于酚类和萜类抑制剂，其结构中独特的化学基团在抑制PTP1B 中起着关键作用。

虽然这些食源性天然产物在抑制PTP1B的研究中取得了一定进展，但尚有些问题需要思考和解决：1）由于PTP1B催化结构域的高带电性质，以及PTPs中活性位点和第二结合位点结构具有同质性，导致靶标选择性不佳。但PTP1B中的pTyr两侧残基对其底物识别具有重要作用，是其他PTPs所不具有的活性中心外围作用位点，因此，建议将此独特的相邻外围位点作为PTP1B抑制剂开发的下一个研究目标；2）大多数PTP1B抑制剂的高带电性是其生物利用度低的主要原因之一，因此，建议针对此化学特性对其进行化学修饰或改性，如减少化合物的负电荷数量、增加化合物的疏水性或开发靶向变构位点抑制剂等；3）尽管天然PTP1B抑制剂表现出显著的抑制效果，但是目前大部分研究都停留在天然产物与PTP1B的体外分子对接模拟阶段，缺乏体内PTP1B抑制活性的验证以及相关调控信号通路的研究，特别是关于体内用药剂量、给药途径、副作用以及不良反应等生物安全性相关的研究甚少。因此，建议研究中可以补充相关代谢组学、转录组学、基因组学和蛋白组学等组学技术，深入探究天然PTP1B抑制剂的生物安全性和分子调控机制；4）随着天然产物活性物质的分离纯化和结构鉴定技术的发展日益成熟，利用活性跟踪法分离和鉴定出了上百种PTP1B抑制剂，但是大部分研究都着重于单一天然产物对PTP1B的抑制作用，对于复配天然产物的PTP1B的抑制研究鲜有报道，缺乏对PTP1B的3 个活性位点和活性中心外围的作用位点的协同抑制的研究，因此，根据天然PTP1B抑制剂的抑制机理，复配出具有协同抑制作用的PTP1B抑制剂有待进一步研究。

总之，食源性天然产物因其结构的多样性和新颖性在疾病的预防和治疗方面发挥着独特的生理活性和作用，为开发和设计新型抗糖尿病药物提供了化学分子模板，本文可为进一步开展食源性天然产物抗糖尿病研究提供理论基础和新思路。

本文《食源性蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂的功能意义和结构-活性关系》来源于《食品科学》2023年44卷17期258-267页. 作者：包美丽, 王振宇. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220922-220. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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