南京中医院樊志敏团队：网络药理学分析+体内外实验搞定7.9分中科院1区！！

● 题目：基于网络药理学的半夏泻心汤治疗结直肠癌的作用及机制研究

● 杂志：Phytomedicine

● 影响因子：IF=7.9

● 发表时间：2023年10月

研究背景

半夏泻新汤（BXD）是一种具有抗结直肠癌（CRC）活性的中药。然而，其生物活性成分及其作用机制仍不清楚。在此，我们采用网络药理学方法探讨了BXD对CRC的作用机制。

数据来源

数据集/队列

数据库

数据类型

详细信息

BXD的主要化学成分

TCMSP

化学成分数据

六种主要化学成分

BXD的主要化学成分的化合物名称和分子结构

PubChem

化合物名称和分子结构数据

六种组分的化学结构

BXD靶点

UniProt

基因集数据

237个潜在靶点

结直肠癌相关基因

GeneCards

基因集数据

19,936个结直肠癌靶点和1966个直肠癌靶点

研究思路

该研究首先通过数据库预测了BXD的主要化学成分及其靶点。并从数据库中获取CRC的相关基因，将化合物靶点与CRC靶点取交集。随后通过蛋白质-蛋白质相互作用网络分析构建BXD化合物-靶点网络。采用GO和京都基因与KEGG通路富集分析，探讨BXD对CRC影响的潜在机制。最后利用裸鼠的CRC细胞模型和CRC异种移植模型进一步确定其作用机制。

主要结果

1. BXD主要生物活性成分的分析与含量测定

HPLC用于鉴定BXD的六种主要化学成分（图1A）。这些组分的化学式如图1B所示。该方法简便可靠，具有良好的线性关系、高精度、重复性和稳定性，可用于有效控制BXD的质量。BXD中6种主要化学成分的含量测定表明，甘草素、芦丁、黄芩苷、人参皂苷Rh2、小檗碱和6-姜辣素的比例为14：1：215.66：6：52：17。

图1 使用HPLC鉴定BXD中的主要化学成分

2. BXD化合物-靶点网络的构建

在BXD中共鉴定出158个符合筛选标准的生物活性化合物，通过网络药理学分析预测了237个潜在靶点。通过19,936个CRC靶点和1966个直肠癌靶点之间的交叉，总共获得了46个治疗靶点。基于这些数据，构建并可视化了BXD化合物-靶标网络（图2）。

图2 化合物-靶标网络

3. 初步探讨BXD对CRC的作用机制

为了进一步探索BXD对CRC影响的机制，我们构建了一个PPI网络(图3A)来研究靶点之间的相互作用，这是根据靶点在网络中的程度来确定的。共有30个靶点具有高度的相互作用，包括AKT1、白细胞介素-6 (IL-6)、MAPK8、MAPK1、血管内皮生长因子a (VEGFA)、JUN、信号转导与转录激活因子3 (STAT3) (图3B)。GO富集分析从细胞成分、分子功能、生物学过程3个方面评价靶点的共同生物学功能(图3C-E)。对相关信号通路进行KEGG富集分析。经分析得到112条相关通路。其中，肿瘤坏死因子信号通路、CRC、PI3K/AKT信号通路和凋亡的相关性最高(表1)。

图3 预测关键目标

表1 KEGG富集通路

4. BXD在体外抑制CRC细胞的增殖和迁移

根据BXD的成分测定，配制浓度为1.5 mg/ml甘草苷、0.106 mg/ml芦丁、22.86 mg/ml黄芩苷、0.6 mg/ml人参皂苷Rh2、5.5 mg/ml小檗碱、1.8 mg/ml 6-姜酚的单体溶液。将这些单体溶液以等比例混合，得到浓度为5.39 mg/ml的混合溶液。BXD对HCT116细胞的IC50为304.5405 μg/ml(图4A)。根据这些数据，分别选取150、304、600 μg/ml作为低、中、高浓度进行后续实验。EdU实验证实，BXD的主要成分在体外能够显著抑制HCT116和SW480细胞的增殖(图4B)。划痕实验和Transwell迁移实验证实，BXD各组分在体外可显著降低HCT116细胞的迁移能力(图4C、D)。

图4 BXD成分对HCT116细胞体外增殖和迁移的影响

5. BXD增加体外CRC细胞中的铁和ROS水平

铁检测实验结果显示，高浓度的BXD主成分混合物处理后，HCT116细胞的总铁水平显著升高(图5A)。HCT116和SW480细胞中的ROS水平也在处理后以浓度依赖性方式增加(图5B)。

图5 BXD成分对HCT116细胞铁和ROS水平的影响

6. BXD通过抑制PI3K/AKT/mTOR轴诱导结直肠癌细胞的铁自噬

Western blot分析显示，BXD的成分可以显著增加自噬标志物LC3 II(微管相关蛋白2轻链3 β)与LC3 I的比值，并增加铁自噬标志物NCOA4的水平。BXD成分还降低了铁死亡标志物FTH1和GPX4的水平(图6A)。根据电子显微镜观察，随着BXD成分浓度的增加，HCT116细胞中的自噬体数量显著增加(图6B)。为了进一步探索作用机制，使用western blot检测细胞内PI3K、AKT和mTOR的水平及其磷酸化形式。结果显示，BXD成分干预可以显著降低HCT116细胞中PI3K、AKT和mTOR的磷酸化(图6A)。使用AKT抑制剂MK2206和AKT激活剂SC79进一步验证BXD对HCT116和SW480细胞信号通路的影响。结果表明，与BXD组相比，AKT抑制剂可进一步增加LC3 II/LC3 I比值和NCOA4水平，降低FTH1和GPX4水平，增加铁和ROS水平，最终抑制增殖。相反，AKT激活剂逆转了这一作用。

图6 BXD的成分诱导CRC细胞发生铁自噬及其机制

7. BXD可抑制体内结直肠癌皮下移植瘤的生长，并增加肿瘤内铁和ROS的水平

采用HCT116细胞建立裸鼠结直肠癌皮下移植瘤模型。结果显示，与对照组相比，BXD组皮下肿瘤的大小和重量均明显下降，其中高剂量组最明显(图7A)。然后解剖肿瘤组织，测定铁含量。结果显示，BXD组肿瘤的铁含量高于对照组，其中BXD- h组增加最明显(图7B)。ROS检测显示，BXD组的ROS水平显著高于对照组，其中BXD- h组最为显著(图7C)。Ox对裸鼠皮下移植瘤的抑制作用略强于BXD-H。Ox和BXD-H对肿瘤内铁和ROS水平的影响相当。

图7 BXD对HCT116裸鼠皮下移植瘤生长及体内铁和ROS水平的影响

8. 初步验证BXD在结直肠癌体内的作用机制

Western blot分析显示，与对照组相比，BXD组的LC3II / LC3I比值和NCOA4水平升高，而FTH1和GPX4水平降低。PI3K、AKT和mTOR的磷酸化也降低(图8)，这与体外数据一致。

图8 BXD抗CRC作用机制的体内验证

文章小结

该研究发现BXD通过铁蛋白自噬途径发挥抗CRC作用,阐明了其诱导铁质自噬的潜在机制。这些发现证明了传统药物在治疗结直肠癌方面的巨大潜力，并支持其在联合化疗、靶向治疗和免疫治疗中更广泛的临床应用。文章通过检索中国药典等文献，鉴定出6种高含量的BXD主要有效成分。通过网络药理学分析，构建BXD化合物-治疗靶点网络。随后基于PPI网络，筛选了最高程度的靶点。结合GO和KEGG分析，将PI3K/AKT信号轴确定为BXD的主要作用靶点。使用体外和体内 CRC 模型验证了研究发现。

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