Molecular Cell | 何川团队开发单碱基分辨度的6mA修饰二代测序方法：DR-6mA-seq

总所周知，生物体的遗传信息主要由脱氧核糖核酸（DNA）上腺嘌呤（A），胸腺嘧啶（T），胞嘧啶（C） 和鸟嘌呤（G）四种碱基千变万化的排列顺序所承载和传递。除了这四种经典碱基组成外，生物体时常会对某些经典碱基或核苷（nucleoside）进行细微的再加工（如甲基化，羟甲基化等），产生表观遗传修饰后的碱基或核苷，从而进一步提高遗传信息编码的多样性、实现不改变DNA序列前提下的遗传信息可调控度。长期以来，甲基化修饰的胞嘧啶（5-methylcytosine, 5mC）被公认为继A、T、C、G四种碱基后的第五种碱基，有时甚至被用作DNA甲基化（DNA methylation）这一类重要表观遗传修饰（epigenetic marks）的代名词，但其实DNA上还存在着多种潜在的表观遗传修饰，其中N6-甲基腺嘌呤（DNA N6-methyladenine, 6mA）就是其中较为重要的一个。

事实上，尽管5-甲基胞嘧啶（5mC）是真核细胞基因组上丰度最高的表观修饰，在原核生物如细菌的DNA上，6mA是最为普遍的 DNA 修饰形式，并在错配修复（mismatch repair）、DNA 复制和转录中发挥着重要的调控作用。不过在物种进化过程中，6mA在原核细胞中的高丰度和重要调节功能，似乎逐渐被5mC所代替，以至于在动物、尤其是哺乳动物细胞的基因组中，6mA修饰普遍维持在很低的水平，其未充分明确的分布规律、可能的调控、以及生物学功能引人好奇，目前在领域内也一直存在着不少为之争论的声音（）。

工欲善其事，必先利其器。可以想见，想要彻底厘清6mA在哺乳动物的特点和功能，研究人员首先需要解决的问题是，如何能在如此庞大的哺乳动物基因组中更可靠、更精准地检测出低水平的6mA修饰所在的位置。

2024年1月11日，芝加哥大学何川（Chuan He）实验室在Molecular Cell上发表Technology文章Sequencing of N6-methyl-deoxyadenosine at single-base resolution across the mammalian genome，为便捷高效地测定6mA位置和修饰水平提供了一种全新的二代测序方法。

如何能在全基因组测序中，将存在共价修饰（covalent modification）的碱基与未加修饰的A、T、C、G碱基区分开？对这一问题的不同回答指向了多种多样的表观修饰测序策略。最简单常见的思路是使用特异性针对修饰碱基的抗体进行免疫沉淀（immunoprecipitation）和随后的二代测序，但这种策略的缺陷也十分明显：非特异性高、碱基水平分辨度低、无法直接对单碱基上修饰水平（modification fraction）进行测定。针对C上的修饰，前人发现了一种更为高效的策略，即用亚硫酸氢盐（bisulfite）处理DNA，将未被修饰的C转化为尿嘧啶（U），5mC等修饰后的碱基不受影响，从而通过后续的测序找出5mC等修饰在基因组中出现的位置和修饰水平（Frommer et al， 1992）。然而，亚硫酸氢盐仅对C碱基有这种作用，对于C外的其他碱基，暂时没有类似的高效化合物能够使用。

在这样的背景下，何川实验室注意到6mA相比未修饰的A，在与T进行互补配对时，形成的沃森-克里克氢键较弱，但依然偏好与T而非其他碱基发生配对。基于这一点，研究人员进一步推想，是否能够进一步削弱6mA与T之间的氢键,使之不再能与T顺利发生配对，而选择与其他三种碱基发生配对。如此一来，6mA所在位置在二代测序数据中就有可能不再表现为A，而是体现为“错配”（mismatch）和“突变”（mutation）。有了这个想法后，研究人员进行了一系列尝试，最终发现，当使用2-硫代-dTTP (2-thio-dTTP) 替代DNA延伸反应中的dTTP，额外在反应体系中加入一定量镁离子和聚乙二醇（PEG），并且使用Bst 2.0 DNA聚合酶且在较低的延伸温度下时，6mA不能顺利和2-thio-dTTP进行配对，而同时会和dATP、dGTP、dCTP发生不同比例的错配。而未修饰的A仍主要与2-thio-dTTP形成配对。为了能利用这一策略更为精确可靠地测定6mA修饰位置和修饰水平，研究人员还设置了两个阴性对照测序文库（sequencing library）：用FTO预先对6mA修饰进行抹除的去甲基化对照文库；用Q5高保真DNA聚合酶延伸的无错配对照文库。只有在两个阴性对照测序文库中没有显著错配的位点，才被认定为预测的6mA位点。同时，在所有文库的建立时还加入了携带一系列已知6mA修饰水平的人工合成短DNA（spike-in probes），用于对基因组DNA上6mA修饰位点进行从错配率（mismatch ratio）到修饰水平的标定（calibration）和换算。由于这种6mA检测方法不需要额外对6mA或者A进行任何处理或转变，直接用Bst 2.0 DNA聚合酶对基因组DNA进行 “读取”即可，由此被命名为DR-6mA-seq。

研究人员首先在人工合成DNA上衡量了DR-6mA-seq的表现，证明了此策略能够便捷、单碱基分辨度、较高准确性和灵敏度地对6mA位点进行检测。随后，他们将其应用于基因组小、甲基化水平高、6mA图谱明确的大肠杆菌（E. coli K-12）DNA上，测定出约21500个高置信度的6mA位点，且大部分位点的修饰程度接近100%，与此前三代测序（SMRT）结果高度统一，而测序显示的6mA修饰富集的一致性序列（consensus motif）正是已知的大肠杆菌K-12菌株的仅有两种6mA甲基转移酶的识别序列。这说明DR-6mA-seq是测定原核基因组6mA修饰的便捷、可靠的新方法。

真核生物尤其是哺乳动物基因组比原核生物庞大得多，而6mA丰度和修饰程度却更低，因此长期以来哺乳动物基因组6mA的测定充满难度。尽管在大肠杆菌基因组上表现优异，DR-6mA-seq在哺乳动物基因组上的表现仍需验证。由于此前一项基于质谱和抗体的测序研究发现，比起正常细胞，人胶质母细胞瘤干细胞以及原代胶质母细胞瘤中的6mA修饰水平显著提高（Xie et al, 2018），因此研究人员选取了NIH/3T3和B104-1-1这一对互为对照的细胞系作为验证对象。B104-1-1是由胚胎成纤维细胞NIH/3T3通过表达激活的Erbb2癌基因转化而来，是一种胶质母细胞瘤模型细胞系。通过质谱（UHPLC-QQQ-MS/MS）和DR-6mA-seq，研究人员均发现，B104-1-1中6mA修饰的水平比起其母细胞系NIH/3T3大幅提高约4倍，且B104-1-1新出现的6mA修饰位点更多地出现在LINE, LTR, SINE, satellite等非编码区域，这一点也与此前用不同方法在其他哺乳动物细胞中测定得到的结论较为一致。总体来说，哺乳动物基因组上6mA位点的修饰程度均较低，序列一致性较低。为了研究这些6mA修饰的可能功能，研究人员还将B104-1-1中6mA修饰图谱与多种组蛋白修饰的ChIP-seq图谱进行了比对，发现6mA修饰和异染色质特异的组蛋白修饰：H3K27me3呈现显著的共定位，但在NIH/3T3细胞中却没有观察到这一现象。这提示了胶质母细胞瘤中的6mA修饰可能与H3K27me3存在相互作用，并且与肿瘤细胞的发生或维持有着重要的关联。

总体而言，DR-6mA-seq作为一种单碱基分辨度的6mA修饰二代测序方法，是目前最便捷和可靠的6mA全基因组测定手段之一。除此之外，它突破性地采用了人工修饰的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）作为区分修饰和未修饰碱基的有力工具，这一策略将来值得被运用在其他DNA和RNA共价修饰的检测上。

何川（Chuan He）教授为本研究的通讯作者，博士生冯欣然（Xinran Feng）、博士后崔晓龙（Xiaolong Cui）和张理升（Li-Sheng Zhang）为共同第一作者。

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.12.021