《食品科学》：吉林农业大学闵伟红教授等：谷氨酸棒状杆菌高丝氨酸脱氢酶单突变体酶学性质表征

蛋氨酸（Met）具有多种生理功能，在医药、饲料、食品等领域得到广泛应用。目前，工业上主要通过化学法和蛋白水解法获得Met，微生物合成法由于过量积累的Met对微生物生长有害，未被大规模应用于工业化生产。 天冬氨酸族氨基酸代谢途径是特异性生产Met的氨基酸代谢途径，减弱或解除 高丝氨酸脱氢酶（HSD）的 抑制作用能够达到通过微生物合成法高产Met的目的。

吉林农业大学食品科学与工程学院的江泽沅，柳羽哲，闵伟红*等在实验室成功构建pET-28a-HSD基础上，对HSD进行基因突变，以获得高活力HSD，并进一步对高酶活力菌株进行酶学性质表征。旨在通过对HSD分子空间结构改造，为以后研究HSD催化机制和构建高产Met工程菌株提供一定的理论依据。

1 HSD突变位点选择

采用同源建模获得HSD三维结构，通过AutoDock对底物进行分子对接，成功构建HSD复合结构（图1）。通过Discovery Studio软件确定底物周围4 Å范围内氨基酸残基，由于保守位点影响底物结合，同时，根据突变原则不能选择CG含量过高位点，因此，选择Asp61和Gly25两个位点进行突变，筛选出酶活力较野生型（WT）提高的突变体。

2 HSD基因饱和定点突变

将全质粒扩增突变PCR产物用琼脂糖核酸电泳进行验证，pET-28a质粒大小约为5 369 bp，HSD基因大小约为1 335 bp，因此，突变PCR产物大小约为6 700 bp。如图2所示，在4 000～7 000 bp范围内靠近7 000 bp处出现一条明亮的条带，表明突变成功。将突变PCR产物转化至大肠杆菌BL21感受态中，经过测序验证突变成功，初筛获得酶活力提高的两个突变体A61L和G25G。测序结果表明，Asp61位点由Asp突变成赖氨酸（Lys），Gly25位点密码子由GGA突变成G。

3 HSD蛋白表达和纯化

将诱导表达的WT、A61L和G25G依次经过前处理和镍柱纯化得到HSD纯化液，SDS-PAGE结果（图3）显示，纯化液在46 kDa附近有明显单一条带，表明HSD蛋白表达成功；Western Blot验证结果表明，HSD纯化液含有HSD蛋白。

4 HSD酶动力学分析

测定数据用软件GraphPad Prism 8进行非线性拟合，如图4所示。WT和突变体的酶动力学曲线符合Hill方程V=V max Sn /（K n ＋S n ），表明HSD为典型的别构酶。由表1可知，A61L和G25G突变体V max 分别是WT的1.21 倍和1.35 倍。相比于WT，A61L和G25G K m 值降低，表明突变体催化效率相较于WT提高，与底物亲和力增强。WT、A61L和G25G的n值均大于1，说明WT和突变体呈正协同性，并且A61L和G25G的n值相对于WT显著变小，说明别构效应减弱。

5 HSD酶学性质

5.1 最适反应pH值和最适温度分析

由图5可知，与WT相比，突变体A61L和G25G最适温度没有显著变化。在高温环境下，A61L和G25G相对酶活力高于低温，且显著高于WT，表明突变体A61L和G25G更加耐高温。此外，与WT相比，突变体A61L最适pH值没有显著变化，为8.0，突变体G25G最适pH值提高至8.5。在碱性环境下，突变体A61L和G25G相对酶活力高于WT，表明突变体更适应碱性环境。

5.2 突变体热稳定性分析

由图6可知，WT和突变体在40 ℃最适温度下水浴保温，随着保温时间延长，WT和突变体相对酶活力持续下降，且下降趋势相似。与WT酶活力半衰期相比，突变体A61L酶活力半衰期增加至5.5 h，G25G酶活力半衰期减少至4.0 h。此外，突变体G25G在反应初期（0～2 h）和反应后期（7～9 h）相对酶活力均高于WT；然而，突变体A61L相对酶活力在整个反应时间内均高于WT。

5.3 金属离子对WT和突变体酶活力的影响

由表2可知，终浓度为20～200 mmol/L的K ＋ 对WT、A61L和G25G有激活作用，随着浓度增大相对酶活力增高，在终浓度为100 mmol/L时WT、A61L和G25G相对酶活力达到最高，随后，增大浓度相对酶活力开始减弱；终浓度为20 mmol/L的Mg 2＋ 对WT、A61L和G25G有激活作用，并且在该浓度下WT和突变体相对酶活力最高，随着浓度增加相对酶活力降低；WT和A61L在Ca 2＋ 终浓度为20 mmol/L和60 mmol/L时被激活，G25G在Ca 2＋ 终浓度20、60 mmol/L和100 mmol/L时被激活，且随着浓度增大相对酶活力减弱。以上结果表明，低浓度的K ＋ 、Mg 2＋ 和Ca 2＋ 是WT和突变体的促进剂，且随着离子浓度增加抑制HSD活力。

5.4 有机溶剂对WT和突变体酶活力的影响

由表3可知，不同体积分数有机溶剂对WT、A61L和G25G均有抑制作用，但5%乙醇对WT有激活作用，在该体积分数下WT相对酶活力达到最大，为115.11%；1%乙腈对A61L有激活作用，在该体积分数下A61L相对酶活力为107.65%；1%、5%、10%乙醇以及1%甲醇对G25G有激活作用，在5%乙醇时相对酶活力达到最大，为125.64%。随着有机溶剂体积分数增大，WT、A61L和G25G相对酶活力下降。

5.5 底物抑制剂对WT和突变体酶活力的影响

由表4可知，WT受Thr反馈抑制和Met阻遏抑制。随着Thr和Met浓度增加，抑制作用显著加强，当Thr和Met抑制剂浓度增加至25 mmol/L时，对WT抑制率分别为83.67%和88.10%。当两种抑制剂组合浓度为25 mmol/L时，WT抑制率达到最高，为93.62%。在Thr、Met和Thr＋Met抑制剂浓度为1～25 mmol/L时，突变体A61L和G25G抑制率均低于WT，结果表明，突变有效地降低了Thr反馈抑制和Met阻遏抑制，且在Thr＋Met浓度为25 mmol/L下，突变体A61L和G25G抑制率达到最高。Thr对WT和突变体抑制作用弱于Met抑制剂，但Thr＋Met抑制作用显著增强。

由于生物遗传密码子存在简并现象，在某一碱基改变后，其原来的某种氨基酸位置译成同一种氨基酸，此现象称同义突变。同义突变不会改变产生的蛋白质，但会对蛋白质水平产生显著影响。同义突变主要是根据密码子偏好性进行最优密码子选择。密码子偏好性是翻译效率的重要决定因素，其通过调节RNA加工、蛋白质翻译和蛋白质折叠等多种过程加快翻译速率，进而提高酶的活性。郑志强利用密码子偏好性对极端嗜热细菌嗜热栖热菌的漆酶编码基因进行密码子优化，得到了酶活力提高86 倍的漆酶；董聪等通过对FAD依赖的葡萄糖脱氢酶进行密码子优化，成功构建高酶活力且稳定表达的重组菌株，表明利用密码子偏好性对酶编码基因进行密码子优化能够提高酶的活性。因此，本研究中突变体G25G在25位点密码子为GGC，WT在25位点密码子为GGA，根据大肠杆菌密码子偏好性分析，GGC密码子偏好性高于GGA密码子偏好性，表明GGC密码子对应的tRNA比GGA密码子对应的tRNA具有数量优势，促进翻译过程中tRNA聚集，进而加速翻译延伸过程，最终提高HSD活性。

HSD晶体结构空间变化和氢键改变均会导致酶活力升高或降低，WT 61位点为保守位点，A61L突变后，在位点侧链形成一个类似细长的棒状结构，解除电荷相互作用，空间位阻降低，更容易与底物相结合，促进酶-底物中间过渡态的形成和转化。相较于WT，突变体A61L Km值由7.011 mmol/L降低到6.276 mmol/L，这也表明与底物作用力增强，提高其酶活力和底物亲和力。

结论

本研究对谷氨酸棒状杆菌HSD关键位点Gly25和Asp61进行饱和定点突变以达到增强底物亲和力和提高酶活力、得到优良单突变体的目的。通过互补引物进行全质粒扩增，获得2 个单突变体A61L和G25G。根据动力学分析，A61L和G25G突变体V max 较WT分别提高到1.21 倍和1.35 倍，突变体与底物亲和力增强。酶学性质结果表明，突变体G25G最适pH值比WT提高，耐酸碱程度增加；2 个突变体最适温度与WT一致，但耐热性较WT提高；突变体A61L酶活力半衰期较WT延长，并表现出良好的稳定性；低浓度K ＋ 、Mg 2＋ 和Ca 2＋ 对突变体有激活作用；部分低体积分数乙醇、甲醇、乙腈和二甲基亚砜对突变体有抑制作用。本研究为优化谷氨酸棒状杆菌HSD代谢途径和促进天冬氨酸族氨基酸生物合成产业发展提供参考依据。

本文《 谷氨酸棒状杆菌高丝氨酸脱氢酶单突变体酶学性质表征》来源于《食品科学》2023年44卷第18期110-116页，作者：江泽沅，柳羽哲，高 欣，曾 琦，闵伟红。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220830-353。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。