《AFM》中科院上海硅酸盐所陈航榕：可注射响应水凝胶输送平台：实现高组织渗透和类声波增强抗肿瘤免疫治疗

近期来自中国科学院上海硅酸盐研究所的陈航榕研究员开发了一种“类声遗传学技术”，利用超声效应结合纳米递送系统来调节特定蛋白质/基因的表达并影响免疫微环境中的信号传导途径，为胰腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)等恶性肿瘤的有效治疗提供了新策略。相关研究成果以“Injectable Responsive Hydrogel Delivery Platform: Enabling High Tissue Penetration and Sonogenetic-Like Potentiating Anti-Tumor Immunotherapy”为题发表在Advanced Functional Materials上。

Part.1/研究背景

免疫疗法，即免疫检查点阻断(ICB)，已对少数患者显示出临床获益，但免疫抑制微环境(IME)阻碍了人体免疫系统的有效激活。此外，肿瘤与IME中相关免疫细胞和基质细胞之间相互作用的特点也给肿瘤的免疫治疗带来了相当大的困难。因此，迫切需要开发新的治疗策略，能够重编程IME，精确激活人体的免疫系统，提高免疫治疗的效率。

Part.2/设计思路

与光动力治疗相比，超声具有优异的组织穿透能力，能够到达更深的区域，实现更精确的局部细胞杀伤。此外，超声波可以调节和结合蛋白质的基因表达，控制细胞行为。因此，作者设计了一种超声介导水凝胶递送平台HA-F127@Ti-MOF-Au/PEG-TK-DOX/PFD(HFTiDP)，同时实现声动力治疗(SDT)，免疫激活和精确化疗。超声和吡非尼酮(PFD)的联合作用增加了血管通透性并溶解细胞外基质(ECM)，促进Ti-MOF-Au和PEG-TK-DOX进入肿瘤区域。Ti-MOF-Au可以通过氧和ROS在细胞内调节IME，而PEG-TK-DOX可以响应内源ROS，产生有毒的DOX。此外，超声介导的ROS生成可以影响耐药相关基因的表达，从而进一步增强化疗效果。

Part.3/研究内容

作者首先合成了Ti-MOF纳米颗粒，随后通过NaBH4还原法在Ti-MOF表面原位生长Au纳米颗粒，制备了Ti-MOF-Au纳米复合材料。多种表征结果证明了Ti-MOF-Au纳米复合材料的成功合成。此外，Ti-MOF-Au可以促进SDT过程中ROS的产生，提高SDT的疗效(图1)。

图1. Ti-MOF-Au的合成与表征

作者进一步分析了Ti-MOF-Au的化学成分和状态。研究发现Ti-MOF-Au中Ti3+含量较高，表明Ti-MOF-Au中存在较多的氧缺陷(图2a)。与Ti-MOF相比，Ti-MOF-Au存在更多的氧空位，电子顺磁共振(EPR)和光致发光(PL)光谱结果证明了这一点(图2c-d)。由于负载的Au纳米粒子的过氧化氢酶活性，Ti-MOF-Au在H2O2存在下产生的氧气量明显更高(图2e)。此外，Ti-MOF-Au在超声刺激下可以生成·OH(图2g)。Ti-MOF-Au显示优异的声动力效果，表明其具有较高的ROS生成能力。因此Ti-MOF-Au可以作为一种新型声敏剂应用于超声介导的SDT。

图2. Ti-MOF-Au的价态和空位表征及SDT性能分析

接下来作者对HA-F127、HA-F127@Ti-MOF和HA-F127@Ti-MOF-Au的细胞毒性进行分析。三种水凝胶在孵育48 h后对BALB/3T3或PANC02细胞产生的毒性可忽略不计，表现出良好的生物相容性(图3a,b)。作者使用荧光探针DCFH-DA通过CLSM检测细胞内ROS。Ti-MOF-Au/PEG-TK-DOX/H2O2+US处理组的绿色荧光强度显著高于其他组，表明Ti-MOF-Au在US和H2O2的共同作用下可以产生更多的ROS(图3d)。PANC02细胞的CalceinAM/PI共染色结果表明Ti-MOF-Au/PEG-TK-DOX/H2O2+US治疗组表现出最显著的治疗效果(图3e)。作者构建了三维PANC02和4T1细胞球，以评估不同材料的肿瘤穿透性能。将Ti-MOF-Au与荧光素FITC探针偶联，与PANC02细胞球体孵育8 h，通过CLSM观察材料在三维PANC02细胞球体中的渗透情况(图3h)。HA-F127@Ti-MOF-AuFITC+PFD+US能深入肿瘤球体，在球体内分布均匀(图3g)。这些发现表明在PFD和US的双重作用下，声敏剂和促化疗药物可以穿透ECM到达肿瘤深部，实现精准高效的肿瘤治疗。

图3. 体外细胞毒性和细胞凋亡评价

将Cy5标记的Ti-MOF-Au封装在HA-F127水凝胶内，然后皮下注射HA-F127@Ti-MOF-AuCy5水凝胶到小鼠体内， 第9天仍可检测到荧光信号，表明HA-F127水凝胶能够延长Ti-MOF-Au在小鼠体内保留时间(图4a)。此外，HA-F127@Ti-MOF-Au可用作CT成像的造影剂，瘤周注射后，在肿瘤部位观察到明显的CT信号，该信号可以保留7天（图4c-d）。

肿瘤硬度的增加会阻碍治疗药物输送到肿瘤深处，其中ECM硬度增加和固体应力升高是肿瘤硬度异常的两种表现。实验表明US、PFD和声敏剂Ti-MOF-Au共同作用，可最大程度地降低肿瘤的硬度(图4e)。在给药后7天采集各组肿瘤样本，观察肿瘤切片中的荧光分布。HA-F127@Ti-MOF-AuFITC+US+PFD治疗组荧光信号分布在整个肿瘤区域，证明超声的机械力、超声作用下的空化效应或声敏剂的能量传递，以及PFD药物均有助于降低肿瘤硬度，从而促进对肿瘤区域的深入渗透(图4g)。

图4. 肿瘤的硬度和穿透性评估

接下来作者利用PANC02荷瘤模型评价HA-F127@Ti-MOF-Au/PEG-TKDOX/PFD(HFTiDP)+US的抗肿瘤效果。将Balb/c雌性小鼠(5-7周龄)随机分为7组，随后在瘤周注射含有不同治疗剂的PBS100 μL。G2-G7组分别于第1、3、5天用US照射，第7天重复处理(图5a)，监测肿瘤生长情况和离体肿瘤重量。如图5b-d所示，HA-F127@Ti-MOF-Au(G4)加入US照射后，肿瘤抑制率约为43.8%，进一步添加PFD(G5)可提高肿瘤抑制率，而添加PEG-TKDOX(G6)可减慢肿瘤生长。HA-F127@TiMOF-Au/PFD/PEG-TK-DOX+US(G7)的肿瘤抑制率高达89%，证实了SDT/原位化疗联合PFD对肿瘤生长的抑制效果最为显著(图5e,f)。此外，G7组的凋亡细胞比例较高，增殖细胞比例较低(图5h,i)，并且G7组胶原纤维和网状纤维的面积分别减少了8.0倍和7.7倍(图5j,k)。综上所述，该水凝胶给药平台在治疗携带PANC02的胰腺癌中能有效达到较高的治疗效果并保证生物安全性。

图5. PANC02肿瘤小鼠体内的抗肿瘤性能

接下来作者研究了ROS介导的细胞凋亡途径。探针JC-1染料从红色荧光明显转变为绿色荧光，可以清楚地检测到线粒体膜电位(MMP)的减少(图6a)，US介导的ROS生成可以破坏线粒体。通过蛋白质印记(WB)进一步评估细胞色素c和Caspase-3的表达水平。HA-F127@Ti-MOF-Au+US组明显降低了细胞色素c蛋白的表达，这反过来又可以激活Caspase-3蛋白的表达，最终导致细胞凋亡(图6b)。HA-F127@Ti-MOF-Au+US组TP53和MDR1基因的表达水平最低，说明US效应联合功能水凝胶可以有效影响耐药基因的表达(图6c,d)。细胞摄取结果表明HA-F127@Ti-MOF-Au+PEG-TK-DOX+US通过克服化疗耐药，在PANC02肿瘤细胞中显示出最高的DOX积累(图6e)。在US或HA-F127@Ti-MOF-Au+US处理后的PANC02细胞中，HSF-1、p53和P-gp蛋白水平均低于未使用US处理的其他组（图6f）。此外，Ti-MOF-Au在US下具有生成氧气和恢复缺氧的能力(图6g)。因此，声敏剂Ti-MOF-Au联合US对减轻缺氧和化疗耐药非常有利，极大地促进了SDT与原位化疗的协同作用，并且US的机械作用促进了活性成分深入肿瘤组织。

图6. 基于Ti-MOF-Au的US介导的ROS生成对细胞耐药性的影响

为了进一步评估HFTiDP+US抑制肿瘤生长的普遍性和有效性，作者建立了带有4T1的三阴性乳腺癌(TNBC)模型。给药方案如图7a所示，评估不同组小鼠的肿瘤生长。HFTiDP+US(G2)治疗的肿瘤生长曲线表现出显著的抗肿瘤功效并有效抑制脾脏的肿大(图7b-d)。G2组对肺转移的最终抑制效率高达90%(图7h)，证实SDT/原位化疗联合PFD治疗对肺转移的抑制效果最强。此外，G2治疗组在肿瘤部位表现出HIF-1α、P-gp和p53表达水平显著下调。G2组成熟DCs明显增多(图7m)，说明SDT/原位化疗联合PFD治疗可显著促进TAAs的呈现，促进DCs的成熟。此外，G2组中IFN-α、IL-6和TNF-α的水平均明显增加(图7o-q)。实验结果表明，该水凝胶可以与原位化疗协同增强SDT，从而诱导肿瘤细胞凋亡并降低耐药性，这也可以使TAMs从M2表型极化到M1表型，激活DCs有效呈递抗原，促进T淋巴细胞浸润肿瘤。

图7. HFTiDP+US的体内抗肿瘤、抗脾肿大、抗肺转移性能及免疫反应

Part.4/总结

首次开发了一种内部共负载Ti-MOF-Au、PEG-TK-DOX和PFD的创新型可注射水凝胶HA-F127，能够在肿瘤区域内长期保留药物。当与US结合时，这种水凝胶能够使纳米药物深入渗透到肿瘤中，从而产生包括SDT、耐药性减弱、免疫系统激活和原位化疗在内的协同效应。此外，化疗前药PEG-TK-DOX对内源性ROS做出反应，释放有毒的DOX杀死肿瘤细胞。声敏剂Ti-MOF-Au表现出超声响应和过氧化氢酶特性，能够产生ROS和O2，不仅有效缓解缺氧并诱导细胞凋亡，而且还可以重新编程IME，从而发挥抗肿瘤功效并抑制肿瘤转移和脾肿大。Ti-MOF-Au的超声效应可以有效调节P-gp/TP53的表达，表现出“类声遗传学”的特征，对超声介导的肿瘤治疗具有重要意义。这种智能响应水凝胶药物递送平台与超声药物协同治疗策略相结合，在治疗耐药和易转移肿瘤方面具有广阔的前景。

https://doi.org/10.1002/adfm.202313723

DOI

10.1002/adfm.202313723