香草醛产量约为365mg/L，厦大团队构建工程化酵母平台MARE

香兰素（香草醛，vanillin）是目前全球使用最广泛的调味剂之一，也是全球产量最大的合成香料品种之一，素有“食品香料之王”之称。这种调味剂具有香荚兰豆香气以及浓郁的奶香，能够起到增香和定香作用，已经广泛应用于食品、饮料、化妆品、日用化学品及医药等行业。

生物合成是生产香草醛的一种更为环保的方法，然而微生物合成香草醛会受到宿主天然代谢的阻碍，香草醛可能会被迅速降解为其他副产物。

为了提高微生物工厂工业化生产香草醛的产量，厦门大学研究团队提出了一种基于 MARE 酵母平台生产香草醛的方法，通过工程化方法提高了酵母中的香草醛生产率。在研究中，研究团队通过删除酿酒酵母中 ADH、AKR 和 ALDR 超家族中的基因合成了香草醛的最高产量，最佳重组菌株在摇瓶中合成的香草醛滴度为 365.55±7.42mg/L。

（来源：Biotechnology for Biofuels and Bioproducts）

这项研究已发表在Biotechnology for Biofuels and Bioproducts上。本文的通讯作者是厦门大学生命科学学院教授袁吉锋，他的研究方向是通过合成生物学技术、代谢工程手段改造和设计高效细胞工厂用于生产各类高附加值产品。

现阶段，微生物合成香草醛的主要障碍是产物会快速转化为相应的醇。也因此，减少非特异性醛还原酶活性的代谢工程策略被视为是一种较为理想的解决策略。此前，领域内已经进行了大量的尝试，初步取得了一些重要进展。

在最新的研究中，袁吉锋团队提出了一种组合删除（combinatorial deletion）策略，并基于这一策略搭建了最小芳香醛还原酵母平台。在 MARE 酵母平台中，研究团队通过一系列工程化修饰增加在酵母中从头合成香草醛的产量。

先前，该研究团队已经证明通过组合删除四个醇脱氢酶（ADH）基因可以减少视黄醛转化为视黄醇的问题。这些证据表明，删除多个基因对于提高酵母中醛的产量十分必要。基于此，该团队首先在酿酒酵母中删除了一组相同的基因 adh6、adh7、sfa1 和 gre2，随后研究人员在试验中观察到删除这一组基因显著改善了香草醛产量。

（来源：上述论文）

接下来，该团队继续删除属于 AKR 家族的一组基因 gre3、gcy1、ydl124w 和 ypr1，以及删除了与 ALDR 家族相关的第三组基因 ari1、ydr541c 和 aad3。经修饰的菌株 JS-MARE3 表现出了防止香草醛还原的最佳性能，48小时之后气相色谱法也未检测到香草醇的存在。研究人员表示，这项工作代表了一项开创性研究，即研究同时删除 10 多种氧化还原酶对提高酵母的醛产量的作用。

构建 MARE 酵母平台之后，研究人员测试了工程化酵母平台是否可以在不形成酒精副产物的情况下从头合成香草醛。该团队先检查了成熟的香草醛生物合成途径，然后构建了两个质粒，即 pRS423-AroZ/OMT 和 pRS425-CAR/PPTase。

香草醛生物合成途径：3-脱氢莽草酸脱水酶（3DSD） 首先将 3-脱氢莽草酸 (DHS) 转化为原儿茶酸 (PCA)。根据相对酶动力学和辅因子的可用性，PCA 可以转化为原儿茶醛（PCAL）或香草酸盐。该途径的最后一步是通过 O-甲基转移酶（OMT）将 PCAL 转化为香草醛，或者通过羧酸还原酶（CAR）将香草酸还原为香草醛。

质粒的试验结果显示，对照菌株产生的主要产物是原儿茶醇和香草醇，仅合成微量香草醛。与对照菌株相比，JS-MARE3 则产生了 79.35±0.39mg/L 的香草醛，且未检测到香草醇。这进一步证实了在 MARE 酵母平台中可以相对稳定从头合成香草醛。

▲图 | 在酿酒酵母中基于 3DSD 介导的途径从头合成香草醛（来源：上述论文）

然后，研究人员通过设计辅因子改善香草醛的合成，发现通过过表达 MetK（I303V）激活 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）循环可以促进 OMT 介导的甲基化过程。

接下来，研究人员探索了提高香草醛产量的双前体合成途径，将辅酶 A 独立途径移植到酵母中用于合成香草醛。结果显示，羟基扁桃酸合酶（HmaS）介导的生物合成途径具有功能性，但是与 CAR 介导的香草醛合成途径并不兼容。这些发现也表明，当引入多种途径生产目标产物时，需要评估酵母细胞内复杂的自我调控机制。

为了进一步提高香草醛生产的性能，该团队还尝试重新配置酵母的中央代谢途径，从而改善香草醛前体 D-赤藓糖 4-磷酸 (E4P) 的供应。引入短双歧杆菌磷酸转酮酶（BbXfpk）和克鲁维梭菌磷酸转乙酰酶（CkPta）后，菌株 JS-VA9 在摇瓶中生产香草醛的产量达到了 352.28±7.03mg/L。

在酵母-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基中，培养 120 小时后，最终经过 24 个基因修饰的菌株 JS-VA10 在摇瓶中合成香草醛的产量达到了 365.55±7.42mg/L。论文中提到，这是已报道的在酵母中以葡萄糖为底物生产香草醛的最高滴度。

“我们的工作为未来在酿酒酵母中以葡萄糖为底物生产香草醛奠定了基础，我们还观察到 MARE 酵母平台可能适用于合成更多醛衍生化合物。我们相信，通过在代谢工程、合成生物学和工艺优化方面的不断进步，最终将实现从葡萄糖可持续生产天然香草醛等化合物。”

素材来源官方媒体/网络新闻

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