《食品科学》：湖南农业大学蒋立文教授等：泡椒凤爪溶烂腐败菌的鉴定及其致腐能力分析

泡椒凤爪是川渝特色风味小吃，是将湿态发酵工艺与肉制品加工技术结合的产品。由于泡椒凤爪营养丰富，有利于微生物生长繁殖，使其在贮藏及销售过程中容易出现溶烂、胀包等品质劣变的现象。自2015年国家规定不能使用过氧化氢作为加工助剂后，辐照杀菌和添加复合防腐保鲜剂便成为了泡椒凤爪保质的主要方法。

湖南农业大学食品科学技术学院的尹含靓、刘洋*和蒋立文*等人通过高通量测序及传统培养法对溶烂泡椒凤爪中的微生物进行菌相分析及分离鉴定，将优势腐败菌接种于泡椒凤爪中判断其致腐能力，旨在为后期防控泡椒凤爪的腐败提供理论依据。

1 高通量测序法分析优势腐败菌

1.1 α多样性分析

由表1可知，所有样品的覆盖率均达到0.99以上，说明本次测序的结果能代表样品中细菌群落组成的真实情况。新鲜样品（ZC0921）的Observed OTUs和Chao1指数比大部分异常样品高，说明溶烂样品中的细菌群落种类相较正常样品下降。同时，异常样品中的 Simpson指数和Shannon指数较低，可能是优势腐败菌抑制了其他微生物的增殖。

1.2 细菌群落组成分析

如图1a所示，溶烂泡椒凤爪样品（YC0411、YC0507、YC0610、YC0623、YC0729、YC0811、YC0917、YC0921）中的优势腐败菌门为厚壁菌门（Firmicutes），而正常样品（ZC0921）中的优势菌门为蓝藻菌门（Cyanobacteria）。YC0921中的厚壁菌门相对丰度在所有异常样品中最低（50.08%），其次为YC0917（85.10%），而2020年8月11日前的样品（YC0411～YC0811）厚壁菌门相对丰度均大于95%，说明随着贮藏时间延长，优势腐败菌门逐渐占据主导地位。

泡椒凤爪样品中细菌群落在属水平上的组成情况如图1b所示。正常样品ZC0921中的优势菌属为Oxyphotobacteria_unclassified（71.27%），Oxyphotobacteria属于蓝藻菌门（Cyanobacteria），其广泛分布于湖泊、土壤等生态环境中，因此Oxyphotobacteria_unclassified可能来源于环境中。而异常样品中的优势菌属为芽孢杆菌属（Bacillus），YC0921中不动杆菌属（Acinetobacter）、链球菌属 （Streptococcus）等也具有较高的相对丰度。随着贮藏时间延长（生产时间越早），芽孢杆菌属的相对丰度增加（从34.68%增加至99.90%），而其他细菌属的相对丰度均下降，说明芽孢杆菌属为导致样品溶烂的主要腐败微生物，其抑制了其他微生物生长，使样品中的微生物种类呈降低趋势。

2 优势腐败菌的分离鉴定

根据高通量测序结果，对溶烂泡椒凤爪样品的潜在腐败菌进行分离纯化，共得到4株典型菌株，其菌落形态及菌体形态如图2所示。菌株623-4表面隆起，质地黏稠；菌株811-2表面扁平有褶皱；菌株917-1表面干燥凸起，有褶皱，边缘不规则；菌株921-4表面光滑，呈放射状。4株菌株革兰氏染色均为阳性，呈杆状，有芽孢。

根据16S rDNA建立系统发育树（表2），可知菌株623-4为甲基营养型芽孢杆菌（B. methylotrophicus L01），相似度达98%；菌株811-2为贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis strain 2586）, 相似度达96%；菌株917-1为枯草芽孢杆菌（B. subtilis isolate BS-1），相似度达100%；菌株921-4为沙福芽孢杆菌（B. safensis strain HNS004），相似度达98%。

3 优势腐败菌的酶活特性

对优势腐败菌株进行蛋白酶及脂肪酶活测定。结果显示，所有菌株均具有一定的蛋白酶及脂肪酶活性 （图3）。菌株921-4蛋白酶活性最强（51.19 U/mL）， 其次为623-4（28.81 U/mL）、917-1（7.36 U/mL）和811-2（5.20 U/mL）。而脂肪酶活性最强的菌株为623-4（3.75 U/mL），其次为811-2（2.92 U/mL），921-4（2.83 U/mL）和917-1（2.08 U/mL）。研究表明，芽孢杆菌通常具有较高的产蛋白酶能力。曹红等从鱿鱼中筛选出1株蛋白酶活性高达（257.67±2.44）U/mL的甲基营养型芽孢杆菌。沙福芽孢杆菌在优化的发酵培养基中蛋白酶活可达69.26 U/mL。此外，芽孢杆菌也是重要的产脂肪酶菌株，徐伟芳等从土壤中筛选出的甲基营养型芽孢杆菌在最适条件下脂肪酶活性达21.22 U/mL。本研究分离得到的4株菌可能对泡椒凤爪中的蛋白质和脂肪均具有一定的降解作用。因此，将分离菌株接种于泡椒凤爪中，进一步验证其对泡椒凤爪的致腐能力。

4 优势腐败菌对泡椒凤爪的致腐性验证

由表3可知，接种不同腐败菌株的泡椒凤爪样品组pH值均高于C组（37 ℃贮藏空白对照），说明4株菌均具有一定的致腐能力，其分泌的酶类物质可以降解泡椒凤爪中的蛋白质产生氨基酸、胺类等碱性物质。

TVB-N值升高主要是由于微生物和内源酶作用于蛋白质产生氨、胺类等挥发性含氮物质。4个处理组的TVB-N值均高于同样贮藏温度下的对照C组 （表3），表明4株芽孢杆菌均对泡椒凤爪具有一定的致腐能力。

油脂中的多不饱和脂肪酸氧化分解会产生醛、酮等物质，其衍生物丙二醛（MDA）通常被用来表示脂质氧化程度。TBARS值越大，说明MDA含量越高，脂质氧化程度也越高。由表3可知，811-2组（0.83 mg/kg）和623-4组（0.82 mg/kg）的TBARS值最高，而917 - 1组（0.41 mg/kg）的TBARS值比C组（0.45 mg/kg）略低，表明菌株917 - 1对泡椒凤爪脂质氧化的影响较小，与体外脂肪酶活性实验（图3）结果一致。有研究表明，肉制品的品质在TBARS值大于0.6 mg/kg时会发生变化，产生不愉悦的氧化风味，因此菌株623-4、811-2和921-4对泡椒凤爪的品质均有一定的影响，可能导致产品脂肪降解并产生异味。C组（0.45 mg/kg）的TBARS值比N组（0.33 mg/kg）高，这可能是由于低温抑制了脂肪氧化。

结 论

本研究通过高通量测序技术与传统培养法对溶烂 泡椒凤爪样品进行菌相分析及腐败菌分离，发现溶烂泡椒凤爪中的优势菌属为芽孢杆菌属，优势菌株为甲基 营养型芽孢杆菌623-4、贝莱斯芽孢杆菌811-2、枯草芽 孢杆菌917-1、沙福芽孢杆菌921-4。菌株921-4蛋白酶活 性最强（51.19 U/mL），而菌株623-4脂肪酶活性最强  （3.75 U/mL）。此外，将4 株菌分别接种于泡椒凤爪 中，测定样品的pH值、TVB-N值和TBARS值判断其致 腐能力。结果表明，分离得到的4 株菌均具有一定的致 腐能力，其中菌株811-2对泡椒凤爪的pH值（5.48）和TBARS值（0.83 mg/kg）影响最大，菌株623-4对泡椒凤 爪TVB-N值（25.10 mg/kg）影响最大。

作者简介

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第一作者

尹含靓 硕士研究生

湖南农业大学硕士研究生，主要研究方向为食品生物技术。以第一作者身份发表文章6 篇，其中在International journal of food science and technology上发表SCI文章1 篇。荣获2022年研究生国家奖学金，校优秀毕业生。

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通信作者

蒋立文 教授

湖南农业大学食品科学技术学院，学术委员会主任，兼任国家自然科学基金评审委员会专家，天津市、浙江省、北京市自然科学基金项目评审专家，中国微生物学会会员，中国豆制品产业（刊物）专家，中国酿造杂志社编委，湖南省食品科技学会理事，湖南省调味品协会理事，湖南省质量技术监督局食品安全专家，湖南省食品质量安全技术协会监事。主要研究方向为食品生物技术，传统发酵食品风味品质形成机理研究与产业化。主持国家自然科学基金面上项目2 项、湖南省重点研发项目1 项，参与国家与省部级项目7 项，横向项目20余项。获湖南省科技进步（技术发明）奖励3 项，获得商业部科技进步奖1 项。主持制定或参与制定湖南省地方标准6 项。获得授权的国家发明专利10 项，专利技术在企业转化4 项。公开发表SCI/EI等科研论文50余篇，主编/副主编参与教材编写4 部。

本文《泡椒凤爪溶烂腐败菌的鉴定及其致腐能力分析》来源于《食品科学》2023年44卷第16期312-317页，作者：尹含靓，刘洋，谭益升，孙军华，蒋立文，杜秋。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220620-200。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：宁波大学食品与药学学院 俞逸岚；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。