皮肤成纤维细胞的培养和计数，你真的会吗？

成纤维细胞

成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要组成成分，它是由胚胎时期的间充质细胞分化而来的。

成纤维细胞能够分泌少量的细胞生长因子，也能合成和分泌胶原蛋白和弹性蛋白，生成诸如胶原纤维、弹性纤维和网状纤维等细胞外基质成分。

成纤维细胞容易培养，取材也非常便利，容易受基因修饰，所以它常常有不同的应用：
1）作为基因修饰的受体细胞应用于细胞核移植、基因表达等方面；
2）作为多种干细胞如胚胎干细胞（ES）和神经干细胞（NSC）等细胞培养的饲养层，其分泌的细胞因子可维持干细胞的未分化状态；
3）可作为研究机体内源性逆转录病毒体外和体内感染性的细胞模型；
4）利用成纤维细胞大量增殖的特性，可用于机体创伤修复包括一般创伤修复和骨创伤修复。

纤维细胞消化计数图和贴壁细胞图（Mira BF摄）

皮肤成纤维细胞培养

01 取材

采集机体皮肤，放入含有双抗（100U/mL青霉素和100U/mL链霉素）的无菌磷酸盐缓冲溶液（PBS），反复洗涤多次，剪除毛茬，去除血污、脂肪和结缔组织，保留真皮层，用眼科剪将皮肤剪成3~4mm的碎片。

02 原代培养

a.胰酶消化法：将皮肤组织块用眼科剪剪碎后，加入适量含有0.02%EDTA的0.25%的胰酶进行消化，置于37℃水浴锅内，每隔10min左右吹打摇晃一次，30min后，用100目过滤网滤掉组织块，将细胞悬液1000g离心5min，去除上清液，用培养液重悬细胞，再次离心重悬后，调整细胞密度至1~5×105个/mL，接种于75mL培养瓶内，放入37℃，5%CO2和饱和湿度的培养箱内进行培养，每2d换液1次。细胞培养液为含10%胎牛血清（FBS）和1%双抗的DMEM培养液。

b.组织块贴壁培养法：将细碎的组织块接种于75mL培养瓶内，均匀铺于瓶底，皮块之间相距1cm，翻转培养瓶，使瓶底向上，置于37℃，5%CO2和饱和湿度的培养箱内进行培养2h，使皮块略微干涸。之后，放正培养瓶，使瓶底向下，加入适量培养液，覆盖瓶底，放入培养箱内进行培养，每2d换液1次，并观察细胞贴壁情况。

03 传代培养

当细胞长到80%~90%汇合度时，开始进行传代培养。吸出培养瓶里的培养液，用已在37℃预热的无钙镁离子的PBS溶液（DPBS）里洗涤3次，去除细胞碎片和残余血清，然后用含0.02%EDTA的0.25%的胰酶在37℃消化2min，观察贴壁细胞变圆时，加入含胎牛血清的培养液终止消化，并用移液器吹打，使细胞脱落，吸取细胞悬液，1000g离心5min，重悬离心2次后，调整细胞密度至1~5×105个/mL，接种于培养瓶内继续培养。

04 细胞冻存

冻存液的配制比例为DMEM: FBS: DMSO=7:2:1。按照传代培养方法对细胞进行消化，离心，去上清液后，用冻存液重悬细胞，调整细胞密度为1~2×106个/mL，取1mL细胞悬液置于1.8mL冻存管内，密封冻存管，并标上细胞类型和冻存时间，将冻存管在4℃冰箱放置30min后，移入-20℃冰箱内1.5h，之后移入-80冰箱内过夜降温，最后将细胞置于液氮内，-196℃长期保存。

05 细胞复苏

将冻存管从液氮中取出，迅速投入到37℃水浴中，并反复摇动冻存管，使之复温，在超净工作台下吸出细胞悬液放入离心管理，1000g离心5min，弃上清，用培养液重悬后，再次离心重悬，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种于培养瓶内，置于37℃，5%CO2和饱和湿度的培养箱内进行培养。

Countstar BF
在细胞培养过程中的应用

在成纤维细胞培养过程中，不管是原代培养还是传代培养，不管是细胞冻存还是细胞复苏，以及后续的各种细胞实验，对细胞浓度和活率的检测都是最基础的工作，也是后续所有实验的前提。Countstar Mira BF全自动细胞分析仪是一款基于图像法检测，通过采集图像中的细胞信息，进行定量分析，可使用配套的Countstar细胞计数板及标准规格血球计数板对细胞进行自动分析。同时兼容3.5/6/10cm细胞培养皿，T25细胞培养瓶，及4槽或8槽腔室载玻片，对培养过程中的细胞生长状态进行监测分析。

细胞计数

细胞的原代培养，细胞的传代培养，细胞药理性检测，细胞增殖活性检测，细胞杀伤能力检测等各类实验的开展，都要清楚地知道细胞的浓度和细胞的活率，以方便我们更好地进行传代接种、处理样本。Countstar Mira BF利用图像识别原理，可得到如细胞浓度、细胞活率等结果，可同时计数5个样品，每个样品自动采集3-5个视野，保证数据的准确性。

汇合度分析

细胞汇合度是通过细胞占所培养的生长区域内的面积百分比来衡量，细胞汇合度常用来评估细胞的传代时机，及时把握时间，对维持细胞表型和培养质量至关重要。

不同培养时期细胞汇合度的分析（原图和识别图）

来源：环凯转载于“Countstar细胞分析”公众号；
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