细胞培养间、生物实验室污染解决办法

关键词：细胞培养间消毒 微生物实验室消毒 过氧化氢消毒 实验室污染 支原体污染 细胞房污染

细胞培养对无菌环境的要求较为严格。对于细胞培养实验室来说，最重要的是杜绝一切可能的污染源。

一、首先我们先来普及一下细胞房常见的污染分类如下：

1细菌污染

特征：大小在0.5~5 μm，比动物细胞小很多。多呈球状或杆状，形态规则，分布均匀；增殖速度快，一般污染后48~72小时爆发式增殖；营养消耗快，培养基很快变黄，变浑浊；镜下观察有明显的定向运动。

处理方法：轻度污染可用10X双抗清洗处理，重度污染建议消杀后丢弃。

2真菌污染

特征：呈链球状或丝状。常形成肉眼可见的菌落，培养基颜色无变化或变紫，仅对局部细胞影响较大，其他地方生长正常。会形成孢子，容易污染其他细胞。

处理方法：真菌污染较难根除，不建议保留，建议消杀后丢弃。

3支原体污染

特征：最小的微生物，无法通过光学显微镜看见，但可通过电镜观察到。感染支原体的细胞，在某一时间点碎片突然增多，随着传代，细胞状态显著变差。支原体污染可通过气溶胶传播，影响同一细胞房其他细胞。

鉴定方法：PCR法、显色法、荧光染色法等。

处理方法：若细胞状态尚可，添加支原体抑制剂培养2-3代可转阴；若细胞状态很差，建议消杀后丢弃。

4黑胶虫污染

特征：无明确定义，镜下无法直接观察到。主要表现为细胞状态差，黑点和碎片多，布朗运动。通过检测发现主要为支原体污染，部分为未知的增殖不明显的微生物污染。

处理方式：若细胞状态尚可，添加黑胶虫/支原体抑制剂培养2-3代可转阴；若细胞状态很差，建议消杀后丢弃。

5细胞交叉污染

特征：即不同的细胞混杂在一起

鉴定方法：

同种属：STR鉴定，多等位基因数大于3个。

（需考虑本身的遗传背景，如EA.hy 926为融合细胞，本身就包含两套遗传信息）

不同种属：PCR法，对种属特异性基因进行扩增，不同种属产物大小不同。

处理方法：建议重新引种。

不管发生哪种类型的污染都会造成相同的结果。即必须重新做实验，因此浪费工作时间，增加实验成本，降低实验重复性。而且以污染细胞和未污染细胞为基础进行试验时，有可能得到的实验结果完全不同。更为严重的是，如果你所研究的细胞是另外一种细胞的话，那所做的所有工作可能会一文不值。

二、细胞污染后的处置

细胞一旦发现有污染出现，应及时对所用试剂和耗材进行清理。耗材可更换新的或者重新高压灭菌，试剂可重新过滤除菌或者更换新批次，操作台和细胞房需用消毒液进行全面清洁消杀后方可复苏新的细胞，以免反复出现污染。

污染防治策略

环境要求：

洁净区10000级，局部100级，定期进行沉降菌检测

环境消毒：每周一次定期消毒灭菌

1） 地面/墙面：84消毒液、新洁尔灭交叉使用，或采用杀孢子剂进行喷洒

2） 环境消毒：定期紫外照射，臭氧熏蒸，采用杀孢子进行空间雾化

3） 仪器设备表面：75%酒精擦拭，或采用杀孢子剂进行喷洒

三、一种新型的细胞间消毒方式

KV-3000过氧化氢干雾灭菌器源于欧盟GMP设计，自身符合洁净区净化要求，不带入任何外源污染的同时高效根除洁净室空间微生物，达到无菌净化的目标。采用了全球最先进的雾化技术，雾化颗粒小于3微米，增效了空间扩散均匀性，迅速弥漫充满整个密闭空间不放过每一处死角，灭菌效果堪佳，其均匀性、无残留及对机器无伤害特征非常吻合细胞房环境消毒及培养箱里面消毒。

KV-3000过氧化氢灭菌优势：

1、杀菌效果好，对嗜热脂肪杆菌芽孢有6个对数值的杀灭率；

2、广谱的杀菌能力，能杀灭包括支原体、真菌、病毒及芽孢在内的200多种微生物，灭菌原理特殊；

3、平均5um干雾颗粒，扩散性优良，迅速并持续的将杀孢子剂扩散到每一个角落，在空气中做不规则布朗运动；

4、性能稳定，非电加热原理，降低了高温容易损坏设备的风险；

5、所采用的杀孢子剂，无色无毒，无残留，安全可靠，完全分解为氧气和水；

6、验证资料齐全，灭菌设备和所采用的试剂均在中国有备案，带CANS认证的检测报告；

7、灭菌时间短，2-3个小时可完成整个灭菌流程，高效节能；

8、设备体积小，操作方便，灵活移动满足不同空间需求，同时适应大空间灭菌；

9、性价比高，节约消毒成本；

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