最大滴度为11.5mg/L，科学家构建「酵母联盟」高产去甲乌药碱

芳香族氨基酸(AAA) 衍生物是一类具有高附加值的化合物，广泛用作食品添加剂、营养保健品、药品等。这些衍生物大多通过化学化工合成或从天然产物直接提取。

随着合成生物学的发展，借助微生物平台合成 AAA 衍生物受到越来越多的关注。

近日，来自爱荷华州立大学化学与生物工程系ZengyiShao团队在Nature Communications上发表论文，题为“Xylose and shikimate transporters facilitates microbial consortium as a chassis for benzylisoquinoline alkaloid production”。

这项研究构建了一个“酵母联盟”，用于有效生产苄基异喹啉生物碱（BIA，异喹啉生物碱）合成前体。这是一类重要的医药化工中间体，已被用来合成一系列重要药物，包括抗肿瘤、抗菌、镇痛、调节免疫功能、抗血小板凝聚、抗心律失常、降压等。

合成过程被分成两个模块并分别由Scheffersomyces stipitis（树干毕赤酵母）和Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）作为细胞工厂，以有效利用每个宿主的独特优势。

结果发现，BIA合成前体 ( S )-去甲乌药碱能够产生最大滴度 (11.5mg/L)，比报道的滴度高近 110 倍。

构建“酵母联盟”作为细胞工厂

研究表明，芳香族氨基酸合成途径主要分为三大模块：中心碳代谢途径（CCM）、莽草酸（SHIK）途径和分支酸（CHA）途径。以葡萄糖为起点，经过 CCM 途径，相继生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P），紧接着二者缩合生成 3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（DAHP），DAHP 经过 SHIK 途径依次生成 SHIK 和 CHA，最终由 CHA 分别生成 L-Trp、L-Tyr 和 L-Phe。

在有关 BIA 生物合成研究中，通过来自酿酒酵母中不同物种的 20-30 种酶的协调表达，从葡萄糖中完全生物合成蒂巴因、氢可酮和诺斯卡品，代表了构建复杂微生物合成平台的重要里程碑，尽管它们产量很低。

生产效率低下的主要原因是合成路径过长，上下游模块均有不同的难点。

过去二十年，对于 BIA 的生物合成，优化集中在：（1）减少酶混杂性；（2）创建酶嵌合体，以避免在错误的区室中发生不正确的加工和糖基化；（3）增强辅因子再生，以提高细胞色素P450和 AAA 羟化酶的活性；（4）来自多个物种的配对酶；（5）滴定基因拷贝数并在空间上分离某些酶以干预副反应；（6）通过测试不同强度的启动子和优化酶活性（尤其是 P450）调节模式。

▲图 | 树干毕赤酵母-酿酒酵母菌群将混合糖转化为 ( S )-去甲乌药碱的示意图（来源：上述论文）

树干毕赤酵母天然能够利用木糖。该团队此前的研究表明，树干毕赤酵母中的莽草酸滴度比酿酒酵母高 7 倍，较酿酒酵母更有潜力作为宿主来生产 AAA 衍生物，因为前者活跃的磷酸戊糖途径（PPP）使赤藓糖-4-磷酸（E4P）的利用率更高；而酿酒酵母易于内质网 (ER) 相关细胞色素 P450s 的功能表达和复杂的翻译后修饰。双方在不足上也可以互补。

因此，该团队构建了一个酵母联盟，利用树干毕赤酵母提供的高活性上游模块和酿酒酵母中优化的下游模块。

使用“酵母联盟”的优点有两个：将复杂的代谢途径划分给不同的底盘有利于实现具有最佳功能的即插即用设计；将长路径划分给两个底盘不仅可以减轻代谢压力，还可以提供平衡两个模块比例的视角。

采用树干毕赤酵母是因为其卓越的木糖同化能力和活跃的戊糖磷酸途径，而招募酿酒酵母是因为之前在解决表达挑战性酶和产生植物源次级代谢产物的困难方面取得了成功。

较报道滴度高 110 倍

莽草酸途径在许多生物体中发挥着重要作用，三种芳香族氨基酸就是通过该途径合成的。

2016 年，该团队就利用树干毕赤酵母，其天然的木糖利用特性使其特别适合生产莽草酸类化合物，莽草酸产量为 3.11g/L，代表当时在酵母中莽草酸途径产物的最高水平。

此外，由于木糖通过 PPP 被同化到中央代谢中，因此改进葡萄糖和木糖的同时利用可能会增加 E4P 供应，从而导致流向 AAA 生物合成途径上游模块（例如莽草酸合成部分）的流量更高。

但是，持续的碳分解代谢物阻遏（CCR）会阻碍树干毕赤酵母在葡萄糖存在下有效地同化木糖。团队研究发现树干毕赤酵母中 CCR 的发生部分归因于参与细胞内木糖同化的基因转录受到抑制。同时也建议调整木糖来源等，以实现更实质性的 CCR 缓解。

树干毕赤酵母的基因组含有七个带注释的木糖转运蛋白，由 XUT1-7 编码。团队发现，SsXut1、SsXut2 和 SsXut4 三种转运蛋白能分别将木糖消耗量提高至 8-16g/L，同时共同利用 34-60g/L 葡萄糖。其他四种只能实现边际共糖利用。

Spathaspora passalidarum已被报道是迄今为止唯一的酵母菌株，天然能够同时利用葡萄糖、木糖和纤维二糖。

因此，团队将Spathaspora passalidarum与树干毕赤酵母同源的三种木糖转运蛋白和两种己糖转运蛋白基因分别构建在质粒 pMG-xyl 中，并分别转化到S. stipitisFPL-UC7 中。最终发现，Ss-xyl-SpXUT1 从S. passalidarum表达 Xut1 ，在高细胞密度发酵（HCDF）中共同利用 26g/L 木糖和 43g/L 葡萄糖。

以上证明了木糖转运蛋白确实能够增强混合糖的利用。

莽草酸作为一种内源性产生的代谢物，能够分泌到培养基。然而，作为天然代谢物，莽草酸表现出单向易位，即不被酿酒酵母同化。

经过文献查证，黑曲霉、构巢曲霉和粗糙脉孢菌具有莽草酸同化能力。将这三种真菌在含有莽草酸作为唯一碳源的基本培养基中培养了 5 天。黑曲霉的生长明显好于构巢曲霉和粗糙脉孢菌（后两者几乎没有生长），强烈表明黑曲霉中存在高功能的莽草酸输入系统。

▲图 | 筛选酿酒酵母有效吸收莽草酸的转运蛋白（来源：上述论文）

最终团队发现，来自黑曲霉的两种奎宁酸转移酶能够促进莽草酸易位至共培养的酿酒酵母，将莽草酸转化为 ( S )-去甲乌药碱。

通过以上优化，最终使得 ( S )-去甲乌药碱的产量达到 11.5mg/L，比报道的滴度高出近 110 倍。

此前，也有科学家构建此类“联盟”，将能够产生紫杉二烯大肠杆菌与表达细胞色素 P450 的酿酒酵母结合。经过优化后，产生了 33mg/L 的含氧紫杉烷。

遵循类似的原理，大肠杆菌联盟被开发和优化，以有效生产黄烷-3-醇，导致滴度比单一培养物提高 970 倍；另外还有产生柚皮素的大肠杆菌/大肠杆菌联合体，其积累的柚皮素比单一培养对照多 6 倍。

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