《食品科学》：长春中医药大学徐晓红教授等：蓝靛果多酚对免疫抑制小鼠调节肠道微生态的作用机制

蓝靛果（Lonicera caerulea L.var.edulis Turcz.ex Herd.）是一种忍冬科忍冬属蓝果忍冬的变种植物，又名蓝靛果忍冬、黑瞎子果、山茄子果等。蓝靛果多酚（LCBP）是蓝靛果中一类重要的活性成分，包括花青素类和花色苷类、酚酸类、黄酮-3-醇类、黄酮醇类、黄酮类化合物等。研究显示，蓝靛果具有保护心脏神经、抗菌、抗炎等多种药理活性，LCBP被认为是这些生物活性的主要有效成分。

长春中医药大学吉林省人参科学研究院的张龄予、潘丽佳、徐晓红等研究采用环磷酰胺（CTX）诱导构建小鼠免疫抑制病理模型，基于PacBio Sequel第三代微生物16S rRNA高通量测序平台检测LCBP干预后模型小鼠结肠内微生物菌群结构变化，结合血液中免疫细胞指标、结肠病理组织学观察与气相色谱-质谱联用（GC-MS）测定肠道内SCFAs含量，探讨LCBP对免疫抑制模型小鼠的免疫功能调节与肠道菌群分布的影响。本研究基于以往对于LCBP的免疫调节功效研究，加入了肠道菌群调节功效考察指标，将肠道微环境调节与免疫功能调节相结合进行关联研究，以期推进蓝靛果深加工产业的科学化发展，延长蓝靛果产业链，进而促进吉林省的生态环境高水平保护和区域经济高质量发展。

01

结果与分析

1.1小鼠一般状态

各组小鼠给药前的状态基本无区别。给药后，空白对照组小鼠表现为毛色正常且有光泽、行动敏捷、腰背平直、眼睛明亮、进食量良好；LCBP高剂量组小鼠出现进食量增加的现象。第17天开始造模后，MC组(模型组)组小鼠出现了轻微的精神萎靡、皮毛疏松、食欲不振、外形消瘦等现象。LCBP高、低剂量组的小鼠较MC组状态均得到不同程度的改善，进食量趋于正常，精神状态良好。

1.2LCBP对小鼠免疫器官指数的影响

由表1可知，与空白对照组比较，MC组小鼠的脾脏指数和胸腺指数极显著降低（P＜0.01），说明小鼠的免疫抑制模型造模成功；与MC组相比，LCBP低剂量组小鼠的脾脏指数显著增加（P＜0.05），LCBP高剂量组小鼠的脾脏指数与胸腺指数均极显著增加（P＜0.01）且接近空白对照组，说明LCBP对免疫抑制小鼠的免疫器官有一定的保护和促进功能恢复的作用，其中高剂量LCBP作用显著。

1.3 LCBP对免疫抑制小鼠血液免疫指标的影响

由表2可知，MC组小鼠白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、淋巴细胞（LYM）、血小板（PLT）、中性粒细胞（NEU）平均低于空白对照组（P＜0.05、P＜0.01），其中WBC、LYM水平极显著下降（P＜0.01），提示免疫抑制模型造模成功。给药21 d后，LCBP低剂量组小鼠的白细胞WBC、淋巴细胞LYM、血小板PLT水平相较MC组均有所回升（P＜0.05），红细胞RBC、中性细胞NEU水平较MC组无显著差异；LCBP高剂量组小鼠的WBC、RBC、LYM、PLT、NEU水平较MC组均有所回升（P＜0.05、P＜0.01），其中WBC、LYM、PLT极显著回升（P＜0.01）。由此可知，LCBP能够提升机体免疫功能细胞水平，其中高剂量LCBP作用显著。

1.4 病理学观察结果

由图1可以看出，空白对照组小鼠结肠形态正常，杯状细胞和U型隐窝数量较多，腺体分布整齐，炎症细胞浸润及渗出程度低。MC组小鼠的杯状细胞和U型隐窝明显减少，腺体排列无序且发生变形，可见炎性细胞浸润，黏膜充血水肿。与MC组相比，LCBP低剂量组小鼠杯状细胞和U型隐窝有所增多，腺体排列较整齐，水肿减轻，炎症细胞浸润减少；LCBP高剂量组小鼠已经表现出正常杯状细胞和U型隐窝，腺体排列整齐，炎症细胞浸润明显变少。说明LCBP可减轻CTX引起的小鼠肠道组织损伤，其中高剂量LCBP作用明显。

1.5 16S rRNA测序结果

1.5.1 肠道菌群Beta多样性分析

由图2可知，空白对照组、MC组、LCBP高剂量组（以下简称LCBP组）3 组小鼠共分析得到OTU物种447 个，空白对照组肠道菌群中共得到413 个OTU，MC组中共得到373 个OTU，LCBP组共得到378 个OTU，3 组共有物种数目311 个；空白对照组特有物种数目21 个，MC组和LCBP组特有物种数目均为10 个。通过OTU数目分布分析得到，免疫抑制模型造成了小鼠肠道菌群数量的减少，而LCBP组小鼠的肠道菌群丰度有一定的回升，由此得出LCBP对免疫抑制小鼠肠道菌群的丰度具有正向调节作用。

1.5.2 肠道菌群Alpha多样性分析

由图3可知，空白对照组小鼠肠道菌群Ace、Chao1指数均高于MC组、LCBP组，但LCBP组小鼠肠道菌群的Ace指数、Chao1指数较MC组均有所回升，说明LCBP对免疫抑制小鼠肠道菌群总体丰度的升高起到了促进作用。MC组小鼠肠道菌群的数量最少，但是Simpson指数与Shannon指数最高，这说明MC组小鼠肠道菌群的均匀度较LCBP组与空白对照组有所升高，可能与有益菌丰度降低、致病菌丰度升高有关。

1.5.3 肠道菌群构成分析

1.5.3.1 小鼠粪便样本在门水平的菌群丰度及差异

从细菌门水平分析，如图4A所示，相对丰度最高的10 个菌群分别为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、ε-变形菌纲（Epsilonbacteraeota）、软壁菌门（Tenericutes）、变形菌门（Proteobacteria）、脱铁杆菌门（Deferribacteria）、狄氏副拟杆菌（Patescibacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、蓝细菌门（Cyanobacteria），其中，厚壁菌门和拟杆菌门为肠道的优势菌群，相对丰度占比约80%以上。拟杆菌门可通过Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）诱导次级免疫应答反应进而调节白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）炎症因子的释放。本研究中，与空白对照组比较，MC组小鼠的厚壁菌门、ε-变形菌纲、变形菌门、狄氏副拟杆菌、放线菌门和蓝细菌门的相对丰度降低。其中MC组小鼠粪便中厚壁菌门的相对丰度较空白对照组降低了46.2%，而其在LCBP组中的平均丰度较MC组提高了28.23%；拟杆菌门在MC组小鼠粪便中相对丰度较空白对照组提升了98.63%，而经过LCBP干预后其相对丰度较MC组降低了16.90%。通过对各组样品中厚壁菌门与拟杆菌门相对丰度的对比分析发现，免疫抑制小鼠肠道中的F/B值（F为厚壁菌门的丰度值；B为拟杆菌门的丰度值）由空白对照组的3.40降低到了0.92，LCBP干预后F/B值提高到1.41。结果表明，LCBP可能通过提升厚壁菌门的相对丰度，同时降低拟杆菌门的相对丰度，以达到调节肠道菌群结构的正向作用；其通过提升F/B值增加有益菌比例，从而增加有益菌代谢产物丰度，降低肠道内炎症反应，促进免疫功能的正向调节。这与2.5.2节中菌群结构分析的结论相一致。

1.5.3.2 小鼠粪便样本在属水平上的菌群丰度及 差异

从图4B细菌属水平上分析，相对丰度排名前10 位的菌属有乳杆菌属（Lactobacillus）、未培养的Muribaculaceae、艾克曼菌属（Akkermansia）、疣微菌科UGG-014（Ruminococcaceae UGG-014）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、螺杆菌属（Helicobacter）、未培养的毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、拟杆菌属（Bacteroides）、臭杆菌属（Odoribacter）、副拟杆菌属（Parabacteroides）。疣微菌科UCG-014可调节脂类代谢，并调节肥胖相关及胃肠道稳态相关的有益共生菌数量 。拟杆菌属为革兰氏染色阴性的杆菌，在机体免疫紊乱或免疫抑制的生理状态下，会导致内源性感染 。乳杆菌属是有益于宿主健康的微生物，能发酵糖类产生乳酸，维护人体健康和调节免疫功能 。从图4B可知，与空白对照组相比，MC组小鼠粪便中的有益共生菌（包括乳杆菌属、疣微菌科UCG-014、螺杆菌属）的丰度均明显下降，其中乳杆菌属的丰度降低幅度最大，为50.72%；艾克曼菌属、拟杆菌属、狄氏副拟杆菌属的丰度较空白对照组明显增加，其中艾克曼菌属的相对丰度由空白对照组的0.04%升高至14.81%。而LCBP组小鼠粪便中上述菌属的相对丰度则趋于向接近空白对照组水平变化。与MC组相比，LCBP组小鼠粪便中的乳杆菌属相对丰度升高，说明LCBP通过调节益生菌及致病菌的分布进而影响胃肠道内稳态。

1.5.4 组间差异显著性分析结果

本研究通过Python软件作图脚本制作三元相图展示空白对照组、MC组、LCBP组小鼠粪便中不同肠道菌群的比重与关系。从图5中可以看出，在门水平上，3 组小鼠粪便中丰度最高的5 个物种为：ε-变形菌纲（Epsilonbacteraeota），其在空白对照组、MC组、LCBP组中占比分别为0.428、0.237、0.334；疣微菌门（Verrucomicrobia），其在空白对照组、MC组、LCBP组小鼠粪便中占比分别为0.002、0.608、0.390；拟杆菌门（Bacteroidetes），其在空白对照组、MC组、LCBP组小鼠粪便中占比分别为0.216、0.428、0.356；软壁菌门（Tenericutes），其在空白对照组、MC组、LCBP组小鼠粪便中占比分别为0.243、0.404、0.353；厚壁菌门（Firmicutes），其在空白对照组、MC组、LCBP组小鼠粪便中的占比分别为0.449、0.242、0.310。其中疣微菌门只在MC组和LCBP组小鼠粪便中出现，艾克曼菌属归属于疣微菌门，其有助于维持消化道健康，其生理活性包括降低糖尿病、炎症及肥胖等疾病的患病概率，用CTX造模后可能使疣微菌门菌群失调，进而激发了机体的免疫反应。

三元相图分析结果显示，空白对照组、MC组、LCBP组小鼠粪便中的肠道菌群分布均发生了改变，与空白对照组比较，MC组小鼠粪便中的ε-变形菌纲、厚壁菌门相对丰度明显降低，而疣微菌门、拟杆菌门和软壁菌门的相对丰度升高。相比于MC组，LCBP组小鼠粪便中这5 种细菌相对丰度均趋向于接近空白对照组水平变化。上述细菌群落组成与图4中的结果一致。

1.6 小鼠粪便SCFAs质量浓度的测定结果

SCFAs通过降低肠道pH值来阻止肠道中致病菌的复制，因此也抑制了感染性疾病的发展。SCFAs具有调节先天免疫的功能，可以影响免疫细胞（巨噬细胞、NEU和树突状细胞）向外周募集。SCFAs混合标准品的GC-MS总离子流图及分析结果分别如图6、表3所示。由图7可知，免疫抑制小鼠的SCFAs总量由空白对照组的1.66 mg/mL降低至0.83 mg/mL（P＜0.01），LCBP干预后，小鼠粪便中的SCFAs总量回升至1.83 mg/mL（P＜0.01），表明免疫抑制模型小鼠粪便结肠内SCFAs含量明显降低，LCBP可能通过干预SCFAs含量变化从而调节体内免疫功能。肠道微生物菌群能够刺激免疫系统的正常发育，并在免疫细胞的成熟过程中发挥着重要作用，乙酸是一种双歧杆菌高产的SCFAs，通过刺激G蛋白偶联受体43抗体（GPR43）调节肠道炎症，帮助维持肠道上皮屏障功能。

如图7所示，CTX导致免疫抑制后小鼠结肠内的6 种SCFAs质量浓度均有一定程度的下降，其中乙酸、丙酸、异丁酸、异戊酸4 种SCFAs的质量浓度较空白对照组极显著降低（P＜0.01），LCBP干预后，6 种SCFAs的质量浓度较MC组均提高，其中，丙酸、异丁酸、正丁酸3 种SCFAs的质量浓度极显著增加（P＜0.01）。结果表明，LCBP可调节肠道菌群分泌SCFAs水平，从而调节肠道的上皮屏障功能以及免疫细胞的募集程度，进而调节机体的免疫状态。

02

多酚可以促进细胞免疫反应，除了抗菌、抗病毒功能外，其还在调节免疫系统中发挥关键作用，可以将自然免疫应答与适应性免疫应答联系起来，促进自然免疫细胞对病原体的识别，诱导特异性免疫应答的产生。本研究以LCBP作为研究对象，采用CTX诱导构建免疫抑制小鼠模型，基于PacBio Sequel第三代微生物16S rRNA高通量测序平台考察LCBP对小鼠结肠内微生物菌群结构分布的影响，结合血液中免疫细胞指标、结肠病理组织学观察与肠道内SCFAs质量浓度的测定探究LCBP对免疫抑制模型小鼠免疫功能调节与肠道菌群分布的影响。结果表明，LCBP能够显著提高免疫抑制小鼠的免疫器官（胸腺、脾脏）指数以及血液中免疫细胞的水平；改善免疫抑制病理状态下结肠组织的炎性等损伤状态，增加免疫抑制小鼠肠道菌群的多样性，改善有益有害菌群分布比例，促进厚壁菌门、ε-变形菌纲、变形菌门、狄氏副拟杆菌、放线菌门和蓝细菌门的生长，抑制拟杆菌门的增殖；显著提高免疫抑制小鼠体内的SCFAs总量，并使乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸6 种SCFAs的质量浓度显著提高。因此，LCBP可能通过调节肠道的上皮屏障功能以及免疫细胞的募集程度，进而调节机体的免疫状态。本研究为植物多酚对人体肠道内环境的调节提供了理论依据，同时为机体免疫调节与肠道环境的关联性研究提供了新的思路与证据，为蓝靛果应用于食品、保健食品、特殊医学用途食品等领域提供了科学依据，为益生元产业中多酚的应用提供了新的方向。本研究通过GC-MS检测技术对肠道微生物的代谢产物SCFAs进行检测，并探索了其与宿主免疫功能的关联性，确认二者存在关联，但对其他肠道微生物类代谢产物的功能仍需进一步探究。

作者简介

通信作者：

张 楠 讲师

长春中医药大学药学院教师，研究方向：天然药物活性成分筛选与中药透皮系统生物等效性研究。中国中药协会人参属药用植物研究会委员，发表中文核心论文6 篇，SCI论文1 篇，主持省级科研课题3 项，厅局级课题1 项，参与完成国家自然科学基金课题2 项，参与国家重点研究计划项目1 项。获得2021年吉林省博士后创新创业大赛优秀奖，作为指导教师指导省级互联网＋创新创业竞赛金奖项目1 项，银奖项目2 项。

徐晓红 教授

长春中医药大学副校长，博士生导师。研究方向：中药穴位透皮系统作用机制与应用研究，中国针灸学会针药结合专业委员会委员，研修访学于新加坡南洋理工大学。发表论文 20 余篇，参编学术著作 20 余部。参与国家“ 973 计划”项目 1 项、国家重点研发项目 1 项，主持及参与省部级课题 8 项。曾获得中华中医药学会科学技术一等奖 1 项、吉林省科学技术进步奖二等奖 2 项。

第一作者：

张龄予 硕士研究生

长春中医药大学硕士研究生，研究方向：中药分析与检验方法方向，硕士期间以第一作者发表文章EI一篇，北大核心一篇；参与国家级项目一项，省级项目一项；作为团队负责人获得创新创业大赛（互联网+、挑战杯、创青春）省赛金奖2项、银奖1项、铜奖1项。

本文《蓝靛果多酚对免疫抑制小鼠调节肠道微生态的作用机制》来源于《食品科学》2023年44卷第15期147-155页，作者：张龄予, 潘丽佳, 侯苏芯, 等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220822-264。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：美娟；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。