利用工程化菌检测肿瘤DNA

撰文丨亦

合成生物学的一大应用是开发细胞内的生物传感器来监测和响应人类疾病，其中工程化菌由于能够进入人类整个胃肠消化道，并且天然地具备转化和直接从环境中获取胞外DNA的能力【1】，在活细胞检测和诊疗中发挥了巨大作用【2-3】。水平基因转移（horizontal gene transfer,HGT）是微生物之间的普遍现象【4】，不仅存在微生物向动植物的转移，还可能出现真核生物向原核生物的转移【5-6】，但用于检测特定的胞外DNA序列和突变的工程化生物传感器尚未被开发。

近日，加利福尼亚大学合成生物学研究所的Jeff Hasty，南澳大利亚健康与医学研究所的Daniel L. Worthley和Susan L. Woods合作，共同在Science上发表了题为Engineered bacteria detect tumor DNA的文章，工程化了一种天然卡氏不动杆菌（Acinetobacter baylyi），使其成功应用于结直肠癌细胞、类器官和肿瘤的DNA检测。

作者首先想知道细菌是否能用于监测哺乳动物DNA。他们在供体人癌细胞的KRAS同源臂内转入了一个卡那霉素抗性基因，生成了一个供体cassette。通过慢病毒转导，作者将其转入3个遗传背景不同的结直肠癌细胞系（RKO，LS174T，SW620）和2个结直肠癌类器官细胞系（RAH057T，RAH038T）。接下来作者在卡氏不动杆菌中插入了一个与KRAS同源臂互补的序列片段，他们分别测试了2 kb和8 bp的插入策略，通过卡氏不动杆菌在卡那霉素平板上的生长情况来衡量HGT。作者在液体培养基和固体琼脂糖培养基中进行了测试，发现无需DNA纯化，工程化菌都能检测到外源DNA，在固体培养基中检测效率更为高效，且小片段插入策略将检测效率提升了10倍左右。

那么工程化菌能否区分野生型和突变型的KRAS呢？作者将带GFP的卡那霉素抗性基因（kanR-GFP）稳定转染至供体RKO细胞系，然后设计了3个靶向野生型KRAS的间隔序列，将其插入卡氏不动杆菌基因组，那么基于CRISPR CAS系统，卡氏不动杆菌会拒绝野生型只能整合进突变型。作者发现只有spacer 2能够做到这一点，于是他们筛选出了能够区分野生型和突变型的工程化菌。

接下来，作者分别在结直肠癌类器官系和结直肠癌小鼠模型中对工程化菌的检测效果进行评估。对于结直肠癌类器官系，他们发现与细胞系结果一致，卡氏不动杆菌整合了供体类器官裂解物的DNA，通过测试，作者估测出了其检测粪便中靶向DNA的阈值，单次为3 pg的质粒或2.7 × 105拷贝的靶向DNA。对于结直肠癌小鼠模型，工程化菌也能准确地检测出肿瘤DNA。最后，作者检验了其在一般癌症DNA中的表现，发现其也能检测和区分靶向DNA。

总的来说，文章将天然具备定殖于胃肠道能力且对健康人体无害的卡氏不动杆菌工程化，在体外鉴定了其作为生物传感器检测结直肠癌DNA的特征，并在体内结直肠癌小鼠模型中得到验证，观察到了水平基因转移，使得生物鉴定特异游离DNA成为可能，具有广泛应用前景。

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adf3974

制版人：十一

参考文献

1. J. C. Mell, R. J. Redfield,J. Bacteriol.196, 1471–1483 (2014).

2. S. Slomovic, K. Pardee, J. J. Collins,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 14429–14435 (2015).

3. F. Sedlmayer, D. Aubel, M. Fussenegger,Nat. Biomed. Eng.2, 399–415 (2018).

4. S. M. Soucy, J. Huang, J. P. Gogarten,Nat. Rev. Genet.16, 472–482 (2015).

5. K. M. Robinson, K. B. Sieber, J. C. Dunning Hotopp,PLOS Genet.9, e1003877 (2013).

6. J. C. Dunning Hotopp,Trends Genet.27, 157–163 (2011).