小分子RHP1通过RHD6-RSL4转录途径ROP通路上游促进植物根毛尖生长

AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是: 小分子RHP1通过作用于RHD6-RSL4依赖的转录途径和ROP信号通路的上游来促进植物根毛尖的生长。

根毛是根表皮中的单细胞突起。根毛的存在大大扩展了根的表面，有利于土壤的固定和水及养分的吸收。根毛也是研究极地生长机制的理想系统。以前的研究已经确定了许多控制根毛发展不同阶段的重要因素。在本研究中，我们利用化学遗传学筛选，报告了一种类固醇分子RHP1的鉴定，它能在纳摩尔浓度下促进根毛的生长，而不明显改变其他发育过程。我们进一步证明，RHP1专门影响根尖的生长，对细胞命运或平面极性没有明显的影响。我们还表明，RHP1通过作用于RHD6-RSL4依赖性转录途径的上游和ROP GTP酶引导的局部信号传导来促进根毛顶端生长。最后，我们证明RHP1对单子叶植物和双子叶植物的不同物种表现出广泛的影响。对RHP1的研究不仅有助于剖析根毛尖的生长机制，而且为改变不同植物物种的根毛生长提供了一个新的工具。

RHP1(Formestane)（Abmole，M3409，纯度>99%）是第二代选择性芳香酶抑制剂，IC50为80 nM。

Figure 1. RHP1 is a specifificregulator of root hair growth through chemical genetic screen.

在第一轮筛选中，有12个化合物被选中。所有的化合物都进行了第二轮筛选，其中野生型拟南芥种子直接在含有第一轮筛选中相同浓度的化合物的24孔板上发芽。发芽后5-6天检查根毛长度。筛选流程图简述于图1（a）。在第二轮筛选中，我们发现一个化合物能特别增加根毛的长度，而不引起其他生长表型的显著变化。我们将这种化合物命名为根毛促进剂1（RHP1），在结构上与普通类固醇接近（图1b）。我们首先研究了RHP1对根毛生长的剂量效应。1纳摩尔的RHP1已经促进了根毛的生长。当RHP1在10纳摩尔时，根毛长度增加了2倍，其作用在500纳摩尔时达到最大，这使得根毛长度几乎增加了3倍（图1c,d）。RHP1从非常低的浓度到10 lM，显示出广泛的影响范围。当应用于25lM的高浓度时，其促进作用略微减弱（图1c,d）。在低浓度下，我们没有观察到其他植物组织的明显变化，包括根、叶和下胚轴。然而，从10 lM开始，主根的长度被轻微抑制（图1e）。当应用25lM时，与DMSO对照相比，主根长度减少了20%（图1e）。因此，我们得出结论，RHP1在广泛的有效浓度范围内促进根毛的生长，在高浓度下有轻微的生长抑制。

Figure 2. RHP1 increases thegrowth duration and speed of root hairs without affecting cell fate or planarpolarity.

以前的研究表明，根毛的生长分为三个阶段：细胞命运的确定；生长的开始；和顶端的生长。因此，我们检查了RHP1在哪个阶段是活跃的。如图2所示，通过根表皮细胞的自发荧光对根毛模式进行显微镜分析，发现RHP1没有改变毛细胞（H细胞）和非毛细胞（N细胞）之间的相邻模式（图2a），表明这种化合物可能不会影响细胞命运。我们利用对N细胞特异性报告线pCPC:: GUS和pGL2::GFP以及H细胞特异性报告线pRHD6::GFP-RHD6的分析进一步验证了这一结果。同样，我们观察到在GUS染色或绿色荧光蛋白（GFP）表达模式方面没有明显的变化（图2b,c）。总之，这些结果表明，RHP1不改变根毛细胞的命运。我们还研究了RHP1是否在根毛生长的后期阶段发挥作用。根毛在起始阶段经常从基底位置沿着毛细胞出现，导致平面极性。我们用光镜观察表明，RHP1处理没有明显改变平面极性（图2d），这一点通过定量分析得到进一步证实（图2e），表明RHP1不影响根毛的启动。我们接下来检查了RHP1是否作用于根毛生长的最后阶段，即顶端生长阶段。为此，我们使用了一个高通量的活体图像观察系统，结合实时检测的CCD相机。连续的视频记录和定量分析显示，RHP1和DMSO处理之间的根毛生长时间有明显差异。在对照条件下，根毛的生长持续了大约280分钟。惊人的是，RHP1的补充将生长时间延长到480分钟，增加了近2倍（图2f-h）。此外，我们发现，RHP1处理后，生长速度也增加了（图2g）。总之，我们的结果表明，RHP1能增强根毛在顶端生长阶段的生长持续时间和生长速度，而不明显影响细胞命运或平面极性。

Figure 3. RHP1 acts upstreamof the RHD6-RSL4-dependent transcriptional pathway.

我们接下来探讨了RHP1促进根毛尖生长的机制。以前的研究已经确定，TF RSL4是根毛尖生长的主调控因子。此外，RHP1诱导根毛尖生长的方式与RSL4过度表达的方式相似。因此，我们首先研究了RHP1是否依赖于RSL4的活性来促进根毛伸长。rsl4-1单一突变体与野生型对照相比，根毛长度减少了52.4%。RHP1使野生型植物的根毛长度增加176%。相比之下，rsl4-1突变体对RHP1的敏感度要低得多，只显示出根毛长度增加了48.6%（图3a,b）。这一结果表明，RHP1处理后根毛的持续生长需要RSL4的正常功能。我们接下来研究了RHP1是否通过直接调节RSL4来促进根毛生长。为了验证这一假设，我们首先通过检查pRSL4::GFP-RSL4稳定转基因植物，检查RHP1是否影响RSL4的分布。在对照培养基上，RSL4只在出现后的头几根根毛的细胞核中被检测到，其荧光信号在启动后迅速消失（图3c，上）。RHP1处理明显增加了信号的持续时间，在信号消失前大约延迟了3-4根根毛（图3c，下）。定量分析显示，RHP1处理后，RSL4的信号强度和总信号也得到增强（图3c-e）。然而，信号的增加并不是由扩大的核区造成的（图3f）。我们进一步调查了RSL4信号的增加是否是通过转录或转录后的调节实现的。定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）分析表明，RHP1处理后，RSL4的转录水平增加了约2倍（图3g）。没有观察到蛋白质丰度的进一步增加，表明RHP1主要通过转录调节促进RSL4的积累。我们接下来分析了据说是RSL4下游的转录物；这些转录物包括EXPANSIN 7（EXP7）、ROOT HAIR SPECIFIC 18（RHS18）、RHS7和RIBONUCLEASE 1（RNS1）。所有这些下游基因在RHP1处理后都上调了2倍以上（图3j），表明RHP1促进了RSL4依赖的转录途径。

Figure 4. RHP1 increases thepolar distribution of ROP2 in root hairs.

以前有报道说，根毛尖的生长也是通过ROP信号的局部激活来维持的。因此，我们还研究了RHP1是否通过调控ROP信号通路来促进根毛尖的生长。为此，我们首先分析了RHP1存在时rop突变体的生长表型。我们发现，rop2-1单一突变体的根毛长度减少了42.4%，而rop24i6三联突变体（敲除ROP2和ROP6，并敲除ROP4）显示与野生型对照相比，根毛长度减少了70.8%（图4a，b）。RHP1处理完全拯救了rop2-1单突变体的生长缺陷。相比之下，RHP1处理后，rop24i6三联突变体的毛发长度没有恢复到野生型水平（图4a，b）。这一结果表明，ROP GTP酶在RHP1作用的下游冗余地工作，以调节根毛的生长。我们接下来探讨了RHP1是否改变了ROP GTP酶在根毛中的空间-时间分布。以前的研究表明，极性定位的ROP2 GTP酶是根毛极性生长的标志，从开始到活跃的生长阶段。这里我们用pROP2::GFP-ROP2转基因系来监测RHP1的影响。在含有DMSO的生长介质上，ROP2从开始到隆起阶段在根毛尖端区域表现出强烈的极性分布。从第三个根毛开始，极性分布逐渐减少，细胞膜信号明显增加。在第10根根毛后，ROP2的信号强度和极性定位都急剧下降（图4c，上图）。RHP1处理增强了ROP2从隆起期到快速生长期的质膜分布（图4c，下图和d），并大大延长了ROP2信号在根毛顶端的局部积累，直到第16根根毛（图4c，下图，d,e）。这一结果表明，RHP1增强了ROP2在根毛尖端的极性分布和局部持续时间。

Figure 5. RHP1 promotes polardistribution of Ca2+ in root hairs.

到目前为止，我们已经表明，RHP1促进了ROP GTP酶在根毛尖端的极性分布。以前有报道说，在ROP信号的下游产生了尖端定位的Ca2+梯度。因此，我们进一步研究了RHP1是否改变了Ca2+的分布，方法是使用成熟的Ca2+传感器GCaMP5，它可以对Ca2+梯度进行比率量化。定量分析显示，RHP1处理后，根毛尖端的Ca2+传感器的信号强度和持续时间都明显增加（图5a，b）。然而，Ca2+振荡率没有明显变化（图5c，d）。为了探索钙信号增加的生理意义，我们研究了正常的Ca2+通量是否需要RHP1发挥作用。据报道，CNGC14是一个钙渗透性阳离子流入通道，对于在根毛顶端建立局部的Ca2+梯度至关重要。当在含有DMSO的培养基上发芽时，cngc14-1突变体显示出根毛的强烈缺陷，并在启动阶段后就停止生长（图5e，f）。RHP1处理未能拯救这些根毛生长缺陷（图5e,f），表明正常的Ca2+流入对RHP1的功能是必需的。总之，这些结果表明，RHP1增加了根毛尖端的Ca2+信号强度和持续时间，以促进根毛生长。

Figure 6. RHP1 reduces actinbundles in both the apical and subapical areas of root hairs.

在终止生长阶段，根毛在次顶点增加了粗大的束，部分延伸到顶点（图6a，中间）。RHP1处理后，从快速生长阶段开始，这种肌动蛋白束减少（图6a，上）。定量分析显示，在RHP1处理后，根尖和根尖下区域的荧光强度和占有率都明显降低，而在快速生长阶段，根毛的根尖下区域的偏斜率降低（图6b-d）。到了终止生长阶段，这种差异变得更加明显，在这个阶段，RHP1诱导根尖下区域的粗纤维束明显减少，在顶端没有可见的纤维束，形成的肌动蛋白阵列与对照组幼苗的快速生长根毛中发现的肌动蛋白阵列相当（图6a，中间）。这一结果与终止生长阶段亚顶区较低的荧光强度和较高的占有率是一致的（图6b-d）。在完全生长阶段，粗大的根毛束从次顶点延伸到顶点（图6a，下）。在这个阶段，DMSO和RHP1处理之间没有明显差异（图6b-d）。总之，RHP1处理导致根毛在快速生长和终止生长阶段的根尖下和根尖区域的肌动蛋白束的减少。

Figure 7. RHP1 shows broadeffects on root hair growth in different plant species.

数据表明，RHP1同时促进了拟南芥中RSL4依赖的转录途径和根毛顶端的局部ROP信号传导。为了进一步扩大这项研究的意义，我们接下来研究了RHP1对农作物的影响，包括水稻和番茄。有趣的是，我们发现RHP1也能促进这些植物的根毛生长，尽管不同植物种类的敏感性不同（图7a-c）。这一结果表明，RHP1对单子叶植物和双子叶植物的根毛尖端生长都有广泛的影响，因此在未来可能有广泛的应用。

鸣谢：ZhongcaiJin, et al. Plant J. 2022 Jun;110(6):1636-1650.