中科院1区-Aging Cell:上海营养健康所揭示中药单体芦丁靶向阻断衰老细胞SASP的作用机制

来源：Aging

早在1881年，著名的演化生物学家奥古斯特·魏斯曼（August Weismann）就在“The Duration of Life”一文中指出，人类之所以会死亡，原因在于不断耗竭的组织无法实现永久性自我更新，因为细胞分裂有其极限【1】。

1961年，美国生理学家莱奥纳多·海弗里克（Leonard Hayflick）通过实验手段证实了魏斯曼的观点。在一次意外之中，他注意到哺乳动物的细胞分裂能力的确有着局限，并多次重复了自己的这一发现，驳斥了当时流行的所谓细胞具有永生性的教科书式的宣传【2】。

除了无法通过分裂修复机体的组织外，衰老细胞其实还具有更多特征。它们会持续分泌大量促炎性因子（衰老相关分泌表型，SASP）到周边微环境中，最终引起局部或系统性炎症；它们还会重塑胞外基质，甚至会引起正常细胞死亡或是抑制干细胞修复功能。目前，衰老细胞裂解（senolysis）、基于免疫的衰老细胞清除以及SASP的中和是三大主流的靶向策略【3】。

衰老细胞裂解是最先在临床前试验中彰显出潜力的抗衰老疗法，因其可以有效激活衰老细胞的凋亡程序并导致这些细胞死亡。例如，Navitoclax和ABT-737可靶向结合BCL-2、Bcl-xL以及BCL-w，促使衰老细胞启动凋亡机器【4，5】。

在不根除衰老细胞的情况下抑制SASP表达，则是缓解细胞衰老相关表型或增龄性疾病的另一种方法。作为SASP特异性靶向药物（senomorphics）的雷帕霉素及其类似物通过抑制mTOR下调SASP表达，可以延长小鼠的健康期和最大寿命。二甲双胍亦可通过激活AMPK而阻断SASP发展，缓解多种增龄相关慢性疾病（如TAME等大型临床试验）【6】。雷帕霉素、二甲双胍这些抗衰明星单品虽然潜力无限，但目前毕竟仍属处方药，而且是药三分毒，如有更安全、更易得的抗衰物质则更能满足大多数中老年群体的需求。

7月21日，中国科学院上海营养与健康研究所孙宇团队于Aging Cell杂志在线发表题为“Rutin is a potent senomorphic agent to target senescent cells and can improve chemotherapeutic efficacy”的研究论文。

该文章利用天然药库筛选、生物化学、细胞生物学、生物信息学、病理学和预临床干预等技术，揭示植物化学小分子Rutin（中文名：芦丁）通过靶向衰老细胞SASP发生发展过程中的早期信号通路，即特异性干扰ATM与HIF1α、ATM与TRAF6之间的协同互作，阻断损伤性信号从ASAP（急性胁迫相关表型）向SASP的渐进性过渡，从而使得衰老细胞失去SASP这一经典特征。

孙宇研究组在前期有关senolytics研究（2021年报道葡萄籽提取物等植物产品中含重要天然小分子PCC1，可以显著延长健康寿命）的基础上【7】，对一新NMA药库开展了规模性筛选。

此次虽尚未再次发现新的senolytics物质，但注意到个别的天然产物表现出senomorphics活性。例如，植物化学成分Rutin（芦丁，称为槲皮素-3-O-芦丁和维生素P），在筛选过程中可以有效抑制SASP表达。研究人员使用了SASP典型效应因子CXCL8作为检测靶标或生物标记物。初步结果表明，在众多的天然产物中，Rutin显著抑制了CXCL8在衰老细胞中的表达。

进一步测试发现，Rutin能够抑制广谱SASP的表达。同目前国际衰老学界至今已经报道的SASP inhibitors相比，Rutin可以达到甚至一度超过其靶向效率。因此在靶向细胞衰老的效率上，Rutin丝毫不输它的国际前辈们。

更加重要的，研究人员惊奇地发现Rutin并不干扰细胞衰老的发生，SA-β-Gal染色阳性率在Rutin存在与否的情况下并无显著性差异。Rutin可以特异性抑制SASP表达，而细胞衰老照常进行。这是否正是很多情况下人们所希望的呢？在作用机制上，他们发现Rutin可以显著抑制DDR反应，或者下调DNA损伤修复活性。在生化反应检测当中，Rutin能够显著降低衰老细胞中ROS生成水平，即能控制随细胞衰老而出现的氧化自由基等活性氧的生物合成。虽然从DDR inhibition到ROS scavenging之间的信号级联已经清晰，但Rutin在DDR上游的准确靶点，依然有待准确解析。

在Rutin处理之后的衰老细胞，表达谱呈现明显变化。GSEA分析结果表明，SASP signature被Rutin明显抑制。GO分析结果显示，Molecular Function中的cytokine activity和metallopeptidase activity均出现显著下调。在3733个基因上调和886个基因下调的同时，Cellular Component和Biological Process均出现大幅变化。通过IP和WB分析，研究人员发现Rutin能够分别抑制ATM同TRAF6、ATM和HIF1α之间的相互作用，而前者ATM同TRAF6互作的减弱，也间接造成了TRAF6同TAK1之间的互作出现弱化。同增殖态细胞相比，衰老细胞呈现出明显上调的ROS生成水平，但Rutin可以下调衰老细胞的这种ROS生成能力。

孙宇团队近年多次发现衰老细胞可通过生成CM（胞外液）的方式促进癌细胞恶性表型，体现在癌细胞获得明显增强的增殖、迁移、侵袭和耐药等恶性特征，但这些获得性特征均可被Rutin显著抑制。尤其在癌细胞耐药方面，Rutin处理下的癌细胞，survival curve出现明显的shift（朝向浓度更高的方向跃迁，本质上属于一种“红移”）。

体外研究结果表明Rutin是一种非常有效的senomorphics药物，那么是否具有一定体内应用价值呢？研究人员随后建立了化疗小鼠模型：基质细胞与癌细胞通过组织重构形成移植瘤，随后进行8周的药物干预。以MIT为主的化疗药物可以造成免疫缺陷型荷瘤小鼠的肿瘤体积显著下降，而Rutin一旦跟化疗联合使用则可进一步降低肿瘤体积。在治疗荷瘤小鼠的过程中，一些SASP典型外泌因子如IL6/CXCL8/AREG/IL1α等均出现显著上调，但这一现象集中出现在基质细胞，而非癌细胞中（后者没有这种特征）。具体而言，尽管癌细胞也出现了衰老标记p16/p21的表达上调，但SASP典型外泌因子在癌细胞中并没有出现显著变化。

为了确定Rutin提高化疗药物抗癌疗效的机制，研究人员进一步分析了DNA损伤和细胞凋亡情况。结果发现Rutin本身并不改变癌细胞的DNA损伤和细胞凋亡指数，但却可以在MIT作用的基础上进一步促进癌细胞这两项指数的上升。随后进行的Rutin联合化疗干预肿瘤的过程中小鼠的血清因子分析和用药安全评估中，发现MIT治疗造成典型的SASP因子如AREG和EREG在小鼠血清水平、蛋白水平显著上升，但却可被Rutin大幅逆转。一些肝肾毒理指标，Creatinine, Urea, ALP和ALT均未发生明显变化。这些数据表明，Rutin具有良好的用药安全性，并没有造成显著的系统毒性。

总体而言，这项研究准确发现Rutin通过干扰衰老细胞中ATM同TRAF6、ATM同HIF1α之间的互作而阻断SASP的发生发展。这种基于植物化学小分子的干扰，使得TRAF6和HIF1α所分别介导的促炎性因子的表达受到显著抑制，即SASP促炎表型的广谱下调。在高等生命的晚期阶段，衰老细胞在组织器官中所起的作用多数是有害的，主要通过高度合成与释放大量促炎性的SASP因子而产生一系列后果。如果从源头切断这种病理影响的来源，则能起到“高原截流”的效果，同时也能一定程度上避免senolytics这类药物给组织微环境中的正常细胞带来的潜在毒性，为将来临床中延长老年个体在晚期阶段的健康寿命提供了一种全新的干预选项【8，9】。

滨州医学院研究生刘函昕、中国科学院上海营养与健康研究所博士后许奇霞为该论文的共同第一作者。中国科学院上海营养与健康研究所孙宇研究员、美国巴克衰老研究所Judith Campisi资深科学家和滨州医学院付强教授为论文的共同通讯作者。该研究工作得到了科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金委、中国科学院战略性先导科技专项、上海市科学技术委员会、中国博士后科学基金会和上海市超级博士后激励计划等资助，以及中国科学院上海营养与健康研究所公共技术平台和动物平台的支持。

参考文献：

1.Winterhalter, P.R. & Simm, A. How Justified is the Assumption of Programmed Aging in Reminiscence of Weismann's Theories? Biochemistry (Mosc) 87, 35-53 (2022).

2.Hayflick, L. & Moorhead, P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res 25, 585-621 (1961).

3.Wong, F., Omori, S., Donghia, N.M., Zheng, E.J. & Collins, J.J. Discovering small-molecule senolytics with deep neural networks. Nat Aging (2023).

4.Zhu, Y. et al. Identification of a novel senolytic agent, navitoclax, targeting the Bcl-2 family of anti-apoptotic factors. Aging cell 15, 428-435 (2016).

5.Yosef, R. et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nat Commun 7, 11190 (2016).

6.Kulkarni, A.S., Gubbi, S. & Barzilai, N. Benefits of Metformin in Attenuating the Hallmarks of Aging. Cell Metab 32, 15-30 (2020).

7.Xu, Q.X. et al. The flavonoid procyanidin C1 has senotherapeutic activity and increases lifespan in mice. Nature Metabolism 3, 1706-1726 (2021).

8.Cohn, R.L., Gasek, N.S., Kuchel, G.A. & Xu, M. The heterogeneity of cellular senescence: insights at the single-cell level. Trends in cell biology 33, 9-17 (2023).

9.Wissler Gerdes, E.O., Misra, A., Netto, J.M.E., Tchkonia, T. & Kirkland, J.L. Strategies for late phase preclinical and early clinical trials of senolytics. Mech Ageing Dev 200, 111591 (2021).

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