中科院1区if8.8：综合代谢-蛋白质组学研究黄芩不同生长阶段的变化

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导读

黄芩是一种功能性食品，具有治疗多种疾病的潜力。黄芩可分为两种类型：子芩（条形）和枯芩（木质部腐烂）。子芩主要用于治疗下焦大肠热证，枯芩用于治疗上焦肺热证。目前，子芩与枯芩差异的实质依据尚不明确。我们通过非靶向代谢组学技术结合无标记蛋白质组学方法，分析它们之间代谢产物积累和蛋白质表达的变化。结果表明，差异代谢产物和蛋白质主要富集在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、苯丙素、类黄酮、黄酮和黄酮醇、异黄酮和花青素生物合成途径中。这些结果揭示了黄芩在不同生长年份的变化，为黄芩选择合适的采收期提供了参考。

论文ID

原名：Integrated metabolomics and proteomics analysis to study the changes in Scutellaria baicalensis at different growth stages

译名：综合代谢组学和蛋白质组学研究黄芩不同生长阶段的变化

期刊：Food Chemistry

IF：8.8

发表时间：2023.03

通讯作者：孙嘉辰

通讯作者单位：天津商业大学生物技术与食品科学学院

实验设计

实验结果

1.不同生长年份黄芩的代谢组学分析

1.1 代谢物的定性和定量分析

我们采用电喷雾电离，在正、负离子模式下对黄芩进行了非靶向液质分析。前期实验结果表明，阳离子模式比阴离子模式可检测到更多的化合物。表S1包含代谢物名称、峰积分值、序列号等详细信息。我们初步鉴定了680种代谢物，使用HMDB数据库注释到了其中的192种代谢物，分类如图S2A所示。

1.2 代谢物的多元统计分析

我们使用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等多元统计分析方法，对处理后的代谢物进行分析，以降低数据维度，提高数据的可解释性和有效性。为了评价代谢组学性能，我们将QC样品加入到每批黄芩样品中。QC样品的典型总离子色谱图如图S2B和S2C所示。我们对样品（包括QC）进行主成分分析，以确定组间的总体代谢物差异和组内代谢物变化（图S2D和S2E）。主成分分析得分图显示，QC样品聚集在中心，枯芩和子芩样品被清楚地分为两个部分，每个样品的六个重复相互重叠，这表明代谢组学分析是可重复和可靠的。如图S2F和S2G所示，每个主成分分析得分图中的所有样本都在95%置信椭圆内。PC1明确区分了枯芩和子芩，分布结果表明，不同黄芩样品之间存在显著差异，代谢产物可以将不同黄芩样品有效分离。样本之间的确切差异通常不能用无监督的PCA算法来解释。在本研究中，我们使用OPLS-DA模型进行了有监督判别分析，以测量不同黄芩样品中代谢物的转化程度。图S2H和S2I显示了样本组间的高度差异，不同组之间有明显差异。通过交叉验证和响应排序检验（RPT），OPLS-DA模型没有显示出过拟合（图S2J和S2K）。基于这些结果，OPLS-DA被证明预测模型有效，可用于分析枯芩和子芩之间的代谢差异。

1.3 差异积累代谢产物的筛选和分类

枯芩和子芩的代谢产物比较如表S2所示。根据代谢组学分析结果，枯芩和子芩之间有227种不同累积的代谢产物，其中上调127种，下调100种（图S2L）。我们将这些代谢物与HMDB数据库进行比较，共注释到70种代谢物。结果表明，在枯芩和子芩的比较中，差异积累代谢物的前10个分类分别是：羧酸及其衍生物（13）、脂肪酰基（11）、黄酮类化合物（7）、有机氧化合物（6）、嘧啶核苷（3）、吡啶及其衍生物（3）和类黄酮（2）（图1A）。

图1（A）差异累积代谢物的分类，（B）差异累积代谢产物途径的富集分析。

1.4 差异积累代谢产物的代谢途径富集分析

代谢途径富集分析可以深入了解不同样本中代谢变化的潜在机制。我们使用KEGG数据库匹配代谢物的代谢途径，并对前20种不同代谢途径进行富集分析，以更直观地分析枯芩和子芩之间的差异（图1B）。结果表明：13个KEGG途径具有显著不同的富集模式（P <0.05），这些途径分别是：氨酰基tRNA、氰基氨基酸代谢、ABC转运蛋白、苯丙氨酸代谢、α-亚麻酸代谢、精氨酸、己烯类、二芳基庚烷和姜酚、酪氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，类黄酮、硫代葡萄糖苷以及黄酮和黄酮醇生物合成（表S3）。

2. 不同生长年份黄芩的蛋白质组学分析

2.1 蛋白质鉴定和分析

在本研究中，我们鉴定出5931个肽和5029个独特肽，使用至少一种独特肽鉴定出了样品中的962种蛋白，其中908种蛋白被定量。结果显示，大多数检测到的肽的长度在9-20个氨基酸之间（图S3A），蛋白质的相对分子量主要在21- 61 kDa之间（图S3 B）。枯芩和子芩之间独有和共有的上调和下调蛋白的数量如图S3C所示。枯芩和子芩之间具有丰度差异的蛋白质汇总在表S4中，其中，我们确定了537种（213种上调和324种下调）。与子芩相比，枯芩中具有丰度差异的蛋白的下调数量大于上调数量，这表明黄芩对根系生长发育的代谢途径有复杂的调节作用。

2.2 丰度差异的蛋白质的功能分类和注释

具有丰度差异的蛋白质的功能分类如图2A所示。从枯芩和子芩中鉴定出的主要功能类别是：碳水化合物转运代谢（11.6%）、翻译后修饰、蛋白质折叠和伴侣蛋白（9.94%）、能量生成和转换（6.19%）、氨基酸转运代谢(5.63%)、胞内转运、分泌和小泡运输（4.50%）以及信号转导机制（3.19%）。不同生长阶段代谢产物变化背后的机制可以通过识别参与关键生物过程的不同丰度的蛋白来解释。然而，我们也发现了许多未知的功能蛋白，它们可能涉及黄芩根部空洞化的各种生物过程。

根据GO富集分析结果，可将具有丰度差异的蛋白质分为三组（生物过程、细胞组成和分子功能）（图2B）。我们通过对枯芩和子芩的GO注释，共发现有746个上调和1069个下调的蛋白，其中13个被分配到生物过程组（主要是代谢过程、细胞过程、生物调节、对刺激的反应和定位）、2个被分配到细胞成分组（细胞解剖实体和含蛋白复合物），以及13个被分配到分子功能组（主要是催化活性、结合活性、抗氧化活性、分子功能调节剂和分子转导活性）。我们根据对具有丰度差异的蛋白质进行GO富集分析，发现不同生长年份的黄芩根中的蛋白质表达可能与催化活性、细胞解剖实体、代谢过程、细胞过程、结合、生物调节、对刺激的反应、含蛋白复合物、定位、抗氧化活性、分子功能调节和分子转导活性有关。

图2（A）具有丰度差异的蛋白质的功能分类，（B）具有丰度差异的蛋白质的功能注释，（C）具有丰度差异的蛋白质的KEGG途径富集统计。

2.3 具有丰度差异的蛋白质的富集途径

我们使用KEGG数据库绘制所有丰度差异的蛋白，以进一步研究不同生长年份黄芩的代谢途径。枯芩和子芩产生了443种不同丰度的蛋白，共有90种途径（表S5）。枯芩和子芩的前20个KEGG途径如图2C所示，包括半胱氨酸和蛋氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、硫代谢、谷胱甘肽代谢、植物激素信号转导、色氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、嘧啶代谢、硒化合物代谢、泛酸和辅酶A生物合成、酪氨酸代谢，抗坏血酸和醛酸盐代谢、赖氨酸降解、维生素B6代谢、卟啉和叶绿素代谢、类黄酮生物合成、泛醌和其他萜类醌生物合成、C5支链二元酸代谢、甘油磷脂代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。在这些代谢途径中，半胱氨酸和蛋氨酸代谢是显著富集的途径（P <0.05）。这些途径在黄芩生长发育的生理生化反应中起着至关重要的作用。

3. 代谢组和蛋白质组的综合分析

基于代谢组学和蛋白质组学数据，我们选择KEGG途径作为载体，并进行了综合分析。蛋白质组和代谢组中涉及的KEGG途径数量如韦恩图所示（图3A），圆圈中的交叉区域代表两个组学鉴定的差异积累代谢物和具有丰度差异的蛋白质所涉及的KEGG途径的数量。蛋白质组和代谢组共有38条常见途径，包括类黄酮生物合成、苯丙素生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、泛酸和辅酶A生物合成、糖酵解/糖异生等（表S6）。通过对这38条常见路径的进一步分析，我们确定了具有最多蛋白和代谢物的前20个KEGG途径（图3B）。此外，根据P值排名的前20个KEGG途径，如图3C所示，从下往上，柱越高，样品中的生物途径就越活跃。近年来，有人提出次生代谢对植物生长发育至关重要，以图3B和图3C的共同途径为次生代谢的主要途径，即类黄酮生物合成和苯丙素生物合成。

为了更好地理解代谢组学和蛋白质组学之间的联系，我们还使用Cytoscape软件对枯芩和子芩的差异代谢产物、具有丰度差异的蛋白质和KEGG途径进行了网络分析。图3D显示，查尔酮异构酶、过氧化物酶、谷氨酸/天冬氨酸-苯丙转氨酶和氯合酶不仅具有最低的P值，而且直接参与类黄酮生物合成和苯丙素生物合成途径。一种代谢产物可以与多种蛋白质结合，一种蛋白质在参与联合通路时也可以与多种代谢产物结合；因此，我们进一步将这些关键代谢产物和蛋白质与相关途径整合在一个网络中。图3E表明，关键途径主要参与类黄酮生物合成和苯丙素生物合成途径，以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、黄酮和黄酮醇、异黄酮和花青素生物合成（表 1）。基于以上结果，我们提出不同的生长年份可能对黄芩根中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、苯丙素、类黄酮、黄酮和黄酮醇、异黄酮和花青素的生物合成有显著影响。

图3（A）参与代谢物和蛋白质的KEGG途径的韦恩图，（B）含有最多的代谢物和蛋白质的前20个KEGG通路，（C）富含代谢物和蛋白质的前20个KEGG通路（按P值排序），（D）使用所有差异代谢产物和蛋白质构建的网络分析，（E）关键途径中代谢物和蛋白质之间的网络分析（AST：天冬氨酸氨基转移酶；CAD：肉桂醇脱氢酶；CHI：查尔酮异构酶；HCT：莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶；PAT：谷氨酸/天冬氨酸-苯丙转氨酶，POD：过氧化物酶；3AT：花青素3-O-葡萄糖苷6′'-O-酰基转移酶；UGT79B1：花青素3-0-葡萄糖苷2′'-氧基转移酶）。

表1通过对差异积累代谢物和丰度差异蛋白质的综合分析获得的关键途径

通过对代谢组学和蛋白质组学分析，我们表征了关键代谢途径的差异调节，包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、苯丙素、类黄酮、黄酮和黄酮醇、异黄酮和花青素生物合成。这些结果有助于阐明黄芩生长发育的复杂调控机制。

1.生长年份对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成的影响

几种芳香族氨基酸（如：苯丙氨酸和酪氨酸），会在植物生长发育过程中积累，并可作为植物的初级和次级代谢产物的生物合成前体。前期研究表明，在逆境生长阶段，苯丙氨酸和酪氨酸显著减少。如图 4所示，我们在本研究中也观察到了类似的结果：枯芩和子芩的苯丙氨酸和酪氨酸含量显著降低。同时，天冬氨酸转氨酶（AST）和谷氨酸/天冬氨酸-苯甲酸氨基转移酶（PAT）的表达以及苯丙酮酸的含量在枯芩和子芩中也显著下调。

苯丙氨酸和酪氨酸减少可能有两个原因。首先，AST、PAT和苯丙酮酸是苯丙氨酸和酪氨酸生物合成的最后一步，在这一过程中发挥着至关重要的作用。因此，苯丙氨酸和酪氨酸含量的降低可以通过AST、PAT和苯丙酮酸的表达降低来解释。第二，苯丙氨酸和酪氨酸可以用作苯丙烷生物合成途径中合成木质素的前体。因此，木质素合成酶含量的降低可能导致枯芩中苯丙氨酸和酪氨酸的下降。

2.生长年份对苯丙素生物合成的影响

木质素是木质部的主要成分，在根系生长、发育、防御和结构支撑过程中发挥着至关重要的作用。苯丙素的合成是木质素生物合成的早期步骤，木质部的腐烂可能是由于木质素浓度的降低造成的。枯芩与子芩相比，参与苯丙烷生物合成的代谢产物和蛋白质下调，包括过氧化物酶（POD）、肉桂醇脱氢酶（CAD）、莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶（HCT）、β-葡萄糖苷酶和绿原酸。POD催化木质素的苯丙烷前体的聚合，并参与木质素形成的最后一步。CAD是木质素生物合成中的一种关键酶，它将肉桂醛转化为相应的醇，赋予木质素的形成和结构多样性。HCT是一种可逆酶，可使香豆酰辅酶A用于木质素合成。β-葡萄糖苷酶位于发育中的木质部的细胞壁中，可以影响木质素的形成。绿原酸是植物中主要的可溶性苯丙烷，也是木质素合成的前体。

如图4所示，与前期研究相比，枯芩和子芩中POD、CAD、HCT、β-葡萄糖苷酶和绿原酸的表达显著下调。这些代谢产物和蛋白质的抑制导致整个木质素生物合成途径的下调和次生壁许多其他成分的变化。此外，木质素是木质部的主要结构聚合物之一。与子芩相比，木质素合成速率的降低会导致枯芩木质部腐烂速率的增加。

图4枯芩和子芩中苯丙氨酸､酪氨酸和色氨酸､苯丙素和类黄酮生物合成的变化;红色表示上调,绿色表示下调(AST:天冬氨酸氨基转移酶;CAD:肉桂醇脱氢酶;CHI:查尔酮异构酶;HCT:莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶;PAT:谷氨酸/天冬氨酸-苯甲酸氨基转移酶,POD:过氧化物酶;3AT:花青素3-O-葡萄糖苷6′'-O-酰基转移酶;UGT79B1:花青素3-0-葡萄糖苷2′'-O-木糖基转移酶)｡

3.生长年限对黄酮类化合物生物合成的影响

植物衰老是一个复杂的退化过程，可能导致整个生物体或单个器官的腐烂和死亡。前期研究结果还表明，由内部因素或环境信号引起的氧化损伤逐渐破坏了根系的形态结构，并导致根系开始腐烂。黄芩是一种多年生植物。经过大约五年的生长，黄芩的根逐渐老化，并从木质部腐烂（称为“空心根”）。造成这种现象的原因有很多，但植物细胞衰老和根组织退化的最初反应之一是活性氧（ROS）的产生。在正常情况下，抗氧化系统将细胞中ROS的产生保持在最低限度。这种平衡可能会被ROS的过度积累所破坏，导致氧化应激，从而破坏细胞结构和功能。植物对氧化应激的反应是增加抗氧化剂的表达，目的是在不利的条件下延长寿命。前期研究报道，阿魏酸是一种酚类化合物，与清除ROS、抑制脂质过氧化和稳定细胞膜有关。在本研究中，阿魏酸在枯芩和子芩中被上调以抑制ROS。黄酮类化合物对植物的功能和结构至关重要，在应对非生物胁迫和清除活性氧方面发挥着重要作用。黄酮类化合物是由多种代谢途径合成的一类次生代谢产物，主要包括黄酮类、黄酮醇、异黄酮和花青素。枯芩和子芩中与类黄酮化合物生物合成相关的差异积累代谢产物和具有丰度差异的蛋白质如图4所示。在枯芩和子芩之间的比较中，参与类黄酮生物合成途径的查尔酮异构酶（CHI）上调。这一结果表明，枯芩中CHI表达的增加可以导致类黄酮生物合成速率的提高。

已有研究表明，糖基化类黄酮成分可因干旱胁迫而升高，这表明类黄酮苷的重要保护作用是应对干旱处理的响应。最近的一项研究表明，由于类黄酮的糖部分作用，糖苷类黄酮含量的升高可以提高植物在渗透胁迫下的保水能力。在本研究中，枯芩和子芩相比较，游离黄酮类化合物（芹菜素和黄芩素）下调；而糖苷类黄酮（芹菜苷、黄芩苷、大豆苷和洋李苷）的含量上调。同样，先前的研究表明，枯芩中芹菜素和黄芩素的含量降低，但黄芩苷的含量增加。通过糖基化修饰黄酮类化合物，这是一个发生在植物体内的内源性过程，可以提高它们对环境的抗逆性。糖苷类黄酮在植物组织中具有较大的优势，其中糖基化提高了类黄酮化合物的稳定性和生物活性，并降低了植物细胞毒性。此外，游离黄酮类化合物和糖基化黄酮类化合物都被证明具有较强的抗氧化作用。植物细胞中糖基化类黄酮亲水性的增加可以防止ROS对细胞结构和成分的破坏。

花青素的糖基化导致其在植物组织中的积累，因此植物更能耐受寒冷、高盐和干旱胁迫。花青素3-O-葡萄糖苷6′'-O-酰基转移酶（3AT）和花青素3-O-葡糖苷2′'-O-木糖基转移酶（UGT79B1）是广泛存在于植物中的常见糖苷酶。3AT和UGT79B1的表达模式与黄芩苷、芹菜苷、大豆苷和洋李苷的积累相似，在枯芩和子芩的比较中也上调。花青素是一种有效的抗氧化分子，可在多种应激下生物合成。此外，糖基化是花青素修饰的重要步骤，主要是为了化合物的颜色稳定性和运输溶解度。作为代谢产物的储存形式，糖基化花青素可以在植物细胞的解毒过程中发挥重要作用。总之，上述研究结果证明了黄酮类化合物糖基化在黄芩衰老过程中的重要性。

类黄酮类化合物的代谢始于通过苯丙素途径的固定碳。经过多种酶促过程，产生了类黄酮类化合物。在类黄酮生物合成途径中，枯芩和子芩相比较，刺芒柄花素含量上调。此外，在枯芩和子芩相比较中，去甲黄素的含量下调，而汉黄芩素的含量上调。前期研究也发现，枯芩中的汉黄芩素含量高于子芩。甲基化已被证明可以促进黄酮类化合物进入细胞，同时防止植物细胞解体。据报道，由于甲基化部分的极性较低，甲基化类黄酮可能有助于保护植物细胞免受水分流失，从而导致当水分胁迫增加时甲基化类黄酮的含量增加。因此，从目前的结果可以推断，黄酮和类黄酮化合物，特别是它们的甲基化衍生物，可能在黄芩对衰老过程的适应或反应中发挥着至关重要的作用。

在类黄酮生物合成途径中，枯芩和子芩相比较，圣草酚含量升高。与之前的报道类似，枯芩中的圣草酚含量高于子芩。黄酮类化合物的羟基化提高了其代谢稳定性和膜渗透性，并增强了其溶解度和抗氧化性。先前的研究也证实，作为ROS的直接清除剂，圣草酚是一种比柚皮素更好的抗氧化剂。由于B环上存在两个羟基，圣草酚表现出比柚皮素更高的抗氧化活性（P值<0.05）。柚皮素通过脱氢、羟基化和甲基化等修饰转化为3,7-二-O-甲基槲皮素。在本研究中，枯芩和子芩中3,7-二-O-甲基槲皮素的含量上调。综上所述，可以推断枯芩中黄酮类化合物的脱氢和羟基化是由于其特殊的结构，如羟基和双碳键，可有效地对抗衰老诱导的黄芩氧化损伤。

枯芩为生长年久的黄芩宿根，善清上焦肺热；子芩为生长年短的黄芩子根，善泻下焦大肠湿热。先前的研究表明，枯芩和子芩中的黄酮类化合物具有生物活性，这可能是枯芩、子芩与炎症疾病之间的重要联系，并可能在清除肺和结肠热证方面发挥重要作用。我们总结了文献中枯芩和子芩主要黄酮类化合物的含量比较（表2）。在本研究中，枯芩和子芩的黄酮类化合物含量存在显著差异，这可能是它们疗效差异的原因。《中国药典》以黄芩苷的含量作为评价和控制黄芩质量的主要标准。总的来说，根据对药用活性成分含量的综合分析，我们确定了黄芩种植五年以上为最佳收获年份。上述发现不仅为不同生长年份药用活性成分的变化提供了解释，而且为枯芩是药典中质量最高的黄芩中药材提供了重要证据。

表2从文献报道和本实验中获得的枯芩和子芩主要活性成分含量的比较

结论

这是第一篇研究从子芩到枯芩阶段复杂的代谢组学和蛋白质组学变化的论文。大量差异积累的代谢产物和具有丰度差异的蛋白质主要参与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、苯丙素、类黄酮、黄酮和黄酮醇、异黄酮和花青素的生物合成。在木质素的生物合成中，苯丙氨酸和酪氨酸是原料。随着黄芩生长年限的增加，苯丙氨酸和酪氨酸含量的降低为空心化提供了必要的条件。木质素生物合成相关酶在苯丙烷途径中的表达减少表明了木质部结构的降解。此外，衰老过程的产生和根结构的损伤共同刺激黄芩的氧化应激反应，促进抗氧化黄酮类化合物的产生和糖基化、脱氢、甲基化和羟基化等结构修饰的发生。然而，总抗氧化进程的显著增加并不能阻止黄芩地走向衰老。总之，这些结果为黄芩在子芩和枯芩阶段的代谢产物转化和蛋白质代谢过程提供了全面的解释。因此，本研究阐明了黄芩生长阶段与其复杂生物过程之间的关系，为确定黄芩的最佳采收时间提供了理论依据，并为根据病情发展选择合适的黄芩品种提供了科学参考。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37027979/

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