一文剖析DNA免疫如何助力单克隆抗体开发

DNA免疫作为新一代的分子免疫手段引入抗体发现领域仅有短短的三十几年历史，但却是发展最快的技术手段之一。早在上世纪90年代，在小鼠中注射质粒载体上抗原编码DNA序列能够引起免疫反应的发现是疫苗发展史上的一个里程碑。自此，DNA免疫作为第三代免疫方式，迅速被业界重视，蓬勃发展，对其机理和应用的研究日新月异，其中，对抗体研发的贡献也不可小觑。

DNA免疫制备抗体的基本原理是将含有目的基因序列的载体DNA递送到动物皮下，皮间，肌肉，脾脏等部位，使外源基因内源化表达并呈递到细胞表面或分泌到胞外，经MHC II途径诱导宿主B细胞在T细胞辅助下，针对外源蛋白生成能产生特异性抗体的B细胞和记忆性B细胞，再利用下游技术检测，分离纯化这些特异性抗体（图一）。

这一方法具有简单、快速、安全、通量高、特异性强等特点。尤其针对一些难于获得的靶点蛋白，比如跨膜蛋白，特有翻译后修饰的蛋白、毒性蛋白、不稳定或半衰期短的蛋白等，DNA免疫是一种非常有前途的技术手段。

图一 ：DNA免疫机理示意图 （J.K.Lam, et.al, Pharmaceutics 2014）

然而，实际应用中，基于该原理开发的抗体却遇到了现实的问题，例如：如何选择合适的免疫途径、免疫佐剂以及免疫方式等。早期临床研究数据表明，通过DNA疫苗免疫的患者血清效价较低，表明该方法没有很好的免疫效果。为了更好地利用DNA免疫技术获得有效抗体，优化这一技术短板显得尤为重要，尤其是针对DNA免疫抗体滴度较低这一短板。这些改进的方向主要集中在免疫原复合物的设计和递送方式的探索。目前，免疫原复合物的优化包括以下几个方向：

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免疫原基因序列的优化

为了提高免疫原蛋白的免疫原性，可以在基因水平上对编码基因进行以下优化：

• 根据宿主的不同，优化三联密码子的使用频率；

• 根据蛋白高级结构，设计不同的免疫原蛋白，比如除完整的全长蛋白之外，可以表达部分蛋白、拼接蛋白、融合蛋白等；

• 对一些特定的蛋白位点进行突变，增加免疫原的可溶性、稳定性或者表达产量等；

• 对特定表位的序列进行改造，从而加强这些表位的免疫原性。

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载体的选择与优化

DNA免疫的载体一般用质粒，跟普通的蛋白表达质粒有很大的相似性，基本的遗传元件是大体相同的。有些载体会加上分子佐剂的序列，进一步加强抗原蛋白刺激的免疫反应。根据免疫原蛋白的性质不同，可以选择不同的载体构建表达质粒，进行DNA免疫，以提高免疫原性。

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免疫剂量和免疫佐剂

免疫剂量跟免疫方式或者免疫途径有密切关系，也跟免疫动物的体重有关，从几微克到几百微克不等。而佐剂分为基因佐剂、蛋白/免疫分子佐剂、化学佐剂和物理佐剂，基因佐剂一般结合在载体设计当中，主要目的是为了增加蛋白表达量和提高免疫原性；免疫分子佐剂，可以设计在载体中，跟抗原分子一起表达，也可以将免疫分子蛋白跟抗原表达质粒一起递送；化学佐剂和物理佐剂，主要目的除了增强免疫反应以外，还参与DNA的递送，比如脂质体可以增加膜融合和渗透，金颗粒由于重金属的特点，可以轻易刺破细胞膜，把DNA递送到膜内。

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免疫原的递送方式

在DNA免疫中，免疫原的递送方式和免疫反应的强度密切相关。DNA免疫的递送方式除和目标组织的选择是密切相关之外，还和免疫动物的种属和年龄也密切相关。目前在DNA免疫中，对于免疫原的递送主要有以下几种递送方式：注射，包括肌肉、静脉、皮下、皮间以及腹腔等；电穿孔或电转移，主要用于肌肉和皮下；基因枪，主要用于皮下、皮间和肌肉。三种方法各有优缺点。肌肉注射简单易操作，可以用到多种组织和器官，但是DNA用量大，需要大量佐剂加强免疫反应。电穿孔可以刺激范围较大的免疫反应，但用量也比较大，对动物的损伤也较大。基因枪用量小，但对动物也有一定损伤。在抗体开发中考虑到时效性，电穿孔和基因枪是两种比较好的递送方式。

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免疫策略

与常规蛋白免疫类似，DNA免疫也需要多次免疫。免疫反应强度和免疫时效性密切相关，一般免疫3-5次，每次间隔2-3周，才能获得较好的抗体滴度，也有研究表明，在10-11天内用基因枪免疫3-5次，同样可以获得较好的抗体滴度；但与蛋白免疫相比单一的DNA免疫策略产生的抗体滴度较低，故推荐选择DNA加蛋白/多肽/细胞的混合免疫策略。在这种免疫设计中，DNA免疫作为初级免疫，诱导宿主B细胞产生表位更多样性的抗体反应，但免疫滴度不会很高；然后用蛋白/多肽/细胞等多种免疫原加强之后，血清中抗体的免疫滴度能获得迅速提高，并且产生大量高特异性、高亲和性的抗体；与此同时还能够减少免疫原蛋白/多肽/细胞的用量。这种DNA初级免疫加蛋白/多肽/细胞等加强免疫的策略已经在小鼠和兔子模型中筛选单克隆抗体的多个成功案例。

优睿赛思为国内为数不多能够提供基于基因枪DNA免疫的CRO公司，其技术溯源到美国麻省医学院卢山教授的DNA疫苗实验室。卢山教授是全球著名的DNA疫苗专家，其主导开发的HIV DNA疫苗目前已经处于II期临床阶段。优睿赛思主导DNA免疫平台的科学家具有10多年的DNA疫苗开发和免疫经验，并对于兔、小鼠等动物均具有丰富的实际操作经验。迄今为止，已利用DNA免疫技术，为国内外客户成功开发了上百个兔单克隆抗体项目。

自2020年起，优睿赛思和南京鼓楼医院、南京大学合作，利用DNA基因枪免疫兔子成功开发针对COV-SARS-2的广谱中和抗体，其研究成果于2021年和2022年相继发表在Emerging Microbes & Infections和Communications Biology杂志上。该研究成果，也表明利用DNA免疫作为初级免疫，能够诱导宿主B细胞产生表位更多样性的抗体反应；同时也解释了为什么用COV-SARS-2最原始野生型的DNA序列进行免疫，也能够获得具有中和从德尔塔 到奥密克隆等各种突变型的广谱中和抗体。（详细回顾： ）

细胞跨膜蛋白是一类在细胞膜上存在并穿越细胞膜的蛋白质，它们在细胞中起着重要的生物学功能作用，也是近年来抗体药物开发的重要靶点。而膜蛋白，特别是具有多次跨膜结构的蛋白在重组表达上存在着以下问题：表达量低、比较难获得具有正确天然构象的膜蛋白。因此，在针对膜蛋白的单克隆抗体开发过程中，使用什么样的免疫原来进行动物免疫，是大家所关注的问题。

如上所述，DNA免疫技术具有能够减少免疫原的用量、利用宿主动物的细胞来表达免疫原能够更好的获得具有天然构象的蛋白等优点，优睿赛思利用DNA免疫技术为客户开发了多个针对跨膜蛋白的兔单克隆抗体。如下案例，利用DNA免疫结合细胞免疫为客户开发针对某跨膜蛋白X的兔单克隆抗体。可以看到，经三次DNA基因枪免疫之后，所用的三只兔子针对靶点蛋白，均具有比较好的滴度（图二）；同时，利用血清针对靶点蛋白高表达细胞系进行流式细胞分析，均呈现出比较好的细胞膜表面结合，并且呈浓度梯度效应，佐证了对天然跨膜蛋白结合的特异性（图二）。

图二

为了进一步提高单克隆抗体的亲和力，和具有细胞膜表面蛋白X结合能力的克隆数目，又按照经典的流程，进行了两次蛋白X过表达细胞株的增强免疫，最终从中选择了一只兔子分离脾脏细胞，利用SMab®平台进行单B细胞分选和体外培养，最终总共分选了960个单B细胞克隆，经FACS筛选之后， 总共获得了67株克隆具有细胞膜表面结合功能（图三）。客户从中选取了22个FACS阳性克隆并构建成重组表达抗体，最终经FACS再次验证，其结果和B细胞上清筛选结果完全一致（部分结果见图三）。

图三

同时，经过序列分析对比，发现所选取的22个克隆呈现出非常好的多样性（图四），再一次证明了兔单克隆抗体和DNA免疫技术结合，所开发出的抗体多样化程度高。

图四

综上所述，DNA免疫对免疫原的要求简单，作为免疫原的高质量DNA容易快速、大量获得；在一些难于获得的抗原靶点上，通过DNA免疫且能够减少对抗原重组蛋白的需求量，并且容易获得针对天然表位的抗体反应；同时，通过DNA免疫还容易获得高亲和力、高特异性和高多样性的单克隆抗体。目前，DNA免疫技术已经成功开发出大量来源于不同种属的单克隆抗体以及纳米抗体，在科研、临床诊断及疾病治疗等应用领域都获得了广泛的应用。

近年来，DNA免疫技术不仅作为一种新型疫苗而且在免疫学基础研究上，都显示出诱人的前景，着眼未来，面向全球市场优睿赛思将利用DNA免疫技术携手国内外合作伙伴共同深耕更多First-in-Class和Best-in-Class的抗体，为人类生命健康做出更多贡献。

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参考文献

1.Specific immune responses in H-2d mice after DNA immunization of HBV core gene. Z Huang, S Lu, N Liu, 中华肝脏病杂志, 1999

2.DNA immunization as a technology platform for monoclonal antibody induction. Shuying Liu, Shixia Wang and Shan Lu, Emerging Microbes & Infections, 2016

3.Intranasal DNA Vaccine for Protection against Respiratory Infectious Diseases: The Delivery Perspectives. Yingying Xu, Pak-Wai Yuen and Jenny Ka-Wing Lam, Pharmaceutics, 2014

4.Heterologous prime-boost vaccination. Shan Lu, Current Opinion in Immunology, 2009

5.Class-Switching of B Lymphocytes by DNA and Cell Immunization for Stereospecific Monoclonal Antibodies against Native GPCR. Yushi Isozaki , Kanta Tsumoto and Masahiro Tomita, Immuno, 2021

6.Generation of High Specificity Antibodies against Membrane Proteins Using DNA-Gold Micronanoplexes for Gene Gun Immunization. Debra T. Hansen, Felicia M. Craciunescu, Petra Fromme, Stephen A. Johnston, and Kathryn F. Sykes, Curr Protoc Protein Sci. 2019

7.A cDNA Immunization Strategy to Generate Nanobodies against Membrane Proteins in Native Conformation. Thomas Eden, Stephan Menzel, Janusz Wesolowski, Philine Bergmann, Marion Nissen, Gudrun Dubberke, Fabienne Seyfried, Birte Albrecht, Friedrich Haag and Friedrich Koch-Nolte, frontiers in Immunology, 2018

Yurogen

公司简介

Yurogen Biosystems （优睿赛思）2015年成立于美国波士顿，并于2018年在武汉光谷设立优睿赛思（武汉）生物科技，服务于亚太市场。2021年优睿赛思生物科技和爱博泰克生物科技（ABclonal Inc.)实现了合并，并成为ABclonal的全资子公司。

Yurogen (优睿赛思）生物科技一贯注重于技术创新及技术转化，Yurogen利用拥有自主知识产权的《基于新一代单B细胞筛选和培养的单克隆抗体开发平台》（SMab®平台），专注于为全球各大科研院所及制药、生物技术、临床诊断行业企业提供高品质的检测、原料单克隆抗体的前端开发高端CRO服务；高通量的SMab®平台在保证单克隆抗体多样性的基础上，能快速高效筛选出高亲和力、高特异性的单克隆抗体并实现重组表达生产，全面超越杂交瘤单克隆抗体开发技术，在CRO市场获得了客户充分信赖及广泛认可。

目前为止，公司已经为国内外客户开发了10000多种兔单克隆抗体，具有丰富的项目经验。ABclonal & Yurogen 致力成为产业科研转化的核心企业，向生命科学研究工作者和应用企业提供全套可靠的技术解决方案。