检验未解之谜：糖化血红蛋白去哪了？

作者 | 杨佳锦

单位 | 中南大学湘雅二医院检验医学科

01

案例经过

某日在审核糖化血红蛋白（HbA1c）结果时，发现有份标本没有结果。这种情况最常见的原因是标本严重贫血或者静置过久使红细胞明显下沉，从而导致检测的血红蛋白量无法满足最低分析要求。查看患者血常规可见其血红蛋白为160g/L，排除贫血后重新摇匀样本上机检查，还是没有结果。于是更换另一品牌仪器复查，同样未出结果，发现原始图谱上缺失了代表HbA1c的峰（图1）。电话告知临床可能存在干扰导致无法检测，隔天重新送检，仍然没有结果。

图1本例报告原始图谱（左侧）及对照图谱（右侧，黑色区域代表HbA1c）

02

案例分析

两台仪器使用的都是离子交换高压液相色谱法（离子交换HPLC），该法根据各类血红蛋白所带电荷不同，采用不同盐浓度的洗脱液将它们分离开来。正常情况下，会出现6个峰（如图1中右侧对照所示），其中左起第五个峰表示HbA1c。该图类似于生化检测中的反应曲线，当图形不规则时提示有干扰，可能出现结果假性降低或升高，甚至没有结果的情况。

图谱异常最常见于血红蛋白变异体干扰，它是由编码血红蛋白珠蛋白链的基因发生突变，引起单个或多个氨基酸发生改变后产生。变异体对HbA1c水平的影响可分为两个方面，一方面可以对HbA1c检测方法造成干扰，导致检测结果错误。表1列举了目前HbA1c常用检测方法检测原理、对常见血红蛋白变异体的检出率以及后者对不同检测方法的影响。

此外，变异体还能影响红细胞寿命或者糖基化速率。因此，目前针对正常血红蛋白人群所制定的各种HbA1c标准，不一定适用于含有变异体的人群。即使能够用其它方法做出结果，但也可能会导致错误的临床决策。

鉴于血红蛋白变异体给HbA1c检测及结果解释带来的挑战。目前有学者建议首次检测HbA1c的患者，应选择可以识别血红蛋白变异体的离子交换高压液相色谱法和毛细管电泳法。

如果识别出血红蛋白变异体，应在检验报告中进行适当的解释和说明，以便让医师和患者知晓血红蛋白变异体的存在，必要时使用持续葡萄糖监测、糖化白蛋白等来评估患者血糖水平。如果未检测到变异体，则该患者在之后的检测中，可以使用任何方法包括床旁实验检测HbA1c。

出现血红蛋白变异体干扰时，往往会有异常峰形和（或）峰的数目改变（图2）。一旦发现这些异常变化，可以采用血红蛋白电泳来验证到底是哪种血红蛋白变异体的干扰。本例标本进行电泳后，其结果竟然完全正常（图3），没有异常峰出现。再细看图1原始结果图形，发现除了没有HbA1c峰以外，其它峰形都很规则，与常见变异体干扰确实不一样。

图2 部分血红蛋白变异体对离子交换HPLC法检测图形的影响

图3 患者血红蛋白电泳图

面对这样困惑的结果，我们请教了厂家应用。对方建议打印查看详细的原始结果（图4），虽然电泳图完全正常，但考虑还是有血红蛋白变异体干扰。毕竟像这种电泳模式完全正常的突变是存在的，如Hb South Florida，不过还有个问题难以用变异体解释。

图4 本例患者标本详细检测信息

患者的红细胞相关参数、网织红细胞计数和镜下形态都正常，如果存在变异体则提示静止型突变，通常属于杂合突变。这种情况下，体内一般只会有部分HbA有结构变异，其余的HbA仍是正常。既然如此，那为何这部分正常HbA糖基化后都没有显示出来呢？

正当一筹莫展之时，图4结果中的一个信息引起了我的注意，那就是L-A1C的面积居然高达47.2%。这个峰代表什么意思呢？

血红蛋白与血糖接触后会有两步反应，首先是血红蛋白的β珠蛋白链氨基末端与血糖结合形成Schiff碱基，然后经Amadori分子重新排列、形成氨基酮化合物（图5所示）。根据试剂说明书描述，Schiff碱基结合产物为不稳定HbA1c（L-A1C，第四个峰所示），可随血糖变化发生即时改变，而Amadori分子重排后才形成稳定的HbA1c（S-A1C，第五个峰所示），反映长期血糖的平均水平，也就是最终需要的结果。

图5 HbA1c形成示意图

因此L-A1C和S-A1C其实就是两兄弟，代表血红蛋白糖基化的两个不同阶段。但该患者血糖水平正常，而且未被诊断过糖尿病。即使用一个血糖为23mmol/L的标本检测，其L-A1C也不过只有4.8%。这些都说明本例标本L-A1C面积存在异常升高。

在厂家提供的资料中，提到L-A1C在肾衰竭患者中会升高。这是因为血红蛋白除了结构变异，还可以发生化学修饰。这些修改可能在物理和化学上模拟HbA1c，导致HbA1c测定不准确，特别是在使用基于电荷差的分离方法时。常见的修饰就是氨基甲酰化，这在尿毒症患者中比较突出。

具体过程就是尿素在体内自发解离形成氨和氰酸盐，然后氰酸盐和血红蛋白发生反应形成氨基甲酰血红蛋白。而恰巧该患者就是一个肾衰竭患者，其尿素和肌酐分别为25.90mmol/L和1175.0μmol/L。难道真的是氨基甲酰血红蛋白在从中作梗吗？

为了验证高尿素对L-A1C的影响程度，特意挑选了一个尿素为52.10mmol/L的标本进行检测，发现其L-A1C面积不过3.3%。此外，有研究表明1mmol/L尿素仅可以在体内产生0.063%氨基甲酰血红蛋白，所以患者L-A1C也是无法用氨基甲酰化血红蛋白进行解释的。

遗憾的是限于技术条件不足，未能用毛细管电泳或一代测序验证是否真的存在罕见的血红蛋白异构体，并且也未查阅到同样问题的文献，因此尚未能明确具体原因。但还是希望能把这种罕见的情况分享出来跟大家交流，如有遇到同样情况，或已知悉原因的话，还望不吝在留言解惑。

03

总 结

在使用HbA1c时，必须了解独立于血糖浓度影响 HbA1c水平的因素，包括红细胞寿命和血红蛋白糖基化速率的变化、检测干扰等。当 HbA1c与平均血糖明显不符时，应全面了解患者病史和家族史，需要特别关注原始图谱和血常规的结果，必要时结合网织红细胞、游离胆红素（间接胆红素）、肾功能、血红蛋白电泳以及铁代谢等实验室检查，对患者的HbA1c结果做出正确解读。如果识别出血红蛋白变异体，应在检验报告中进行适当的解释和说明，提示临床医师结合血糖、糖化白蛋白或其它 HbA1c方法结果来综合评估患者血糖水平。

参考文献

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编辑：徐少卿 审校：陈雪礼