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自发现以来，CRISPR-Cas系统已经被大规模应用于基因编辑和基因表达调控【1】。近年来，基于CRISPR系统的基因编辑技术已经从实验室走向临床【2】，在遗传性疾病的治疗中发挥不可替代的作用 。
在已知的Cas蛋白中，SpCas9和AsCas12a具有较高的基因编辑活性和较强的组织兼容性，因此被广泛的应用于基础研究中。然而SpCas9和AsCas12a在体内基因治疗中的应用受限于缺少高效、安全的递送系统。腺相关病毒（AAV）具有低病原性和免疫原性，并拥有良好的组织特异性，是目前基因递送的最佳选择【3】。但由于Cas9和Cas12a家族蛋白体积较大 （超过1300个氨基酸） ，难以被高效包装在单个AAV载体中。因此，开发小型高活性CRISPR-Cas系统具有重要意义。
Cas12f是迄今发现的最小Cas家族蛋白之一，只有SpCas9大小的1/3左右【4】。Cas12f可以被单个AAV载体包裹递送，并在哺乳动物细胞和小鼠中具有双链DNA切割活性【5-8】。然而与Cas9和Cas12a家族蛋白相比，Cas12f家族蛋白在哺乳动物细胞中的活性相对较低，限制了其在基因调控和基因治疗中的应用。
2023年7月3日，芝加哥大学汤玮欣课题组和赵明磊课题组在Nature Chemical Biology杂志上发表题为An engineered hypercompact CRISPR-Cas12f system with boosted gene-editing activity的文章。该研究开发了工程化的AsCas12f（enAsCas12f） 。与野生型AsCas12f相比【5】，enAsCas12f显著提高了野生型AsCas12f的基因编辑活性，并保持了较低的脱靶效应。
作者首先通过与比对Cas12f家族蛋白序列，在AsCas12f的非保守位置引入赖氨酸 （lysine） 和精氨酸 （arginine） ，旨在增强AsCas12f与DNA和guide RNA的结合。作者随后将多个有效突变组合，从而获得了enAsCas12f蛋白。enAsCas12f蛋白在体外具有比野生型AsCas12f更高的DNA切割效率。enAsCas12f在哺乳动物细胞内不同基因组位点上的DNA编辑活性是野生型AsCas12f的2到11.3倍，在特定位点可引入最高69.8%的DNA片段插入或缺失。
为了了解AsCas12f的工作原理，作者使用冷冻电镜解析了AsCas12f-sgRNA-DNA复合物的结构，分辨率为2.9Å。与Cas12f家族的另一蛋白UnCas12f类似【9-10】，AsCas12f以二聚体的形式结合sgRNA和DNA。AsCas12f系统包含较长的sgRNA （193nt） 。借助结构分析和RNA结构设计，作者得以将sgRNA的长度缩短三分之一而不影响AsCas12f系统的DNA切割活性，进一步缩小了该系统的体积。
作者最后使用GUIDE-seq【11】检测了工程化AsCas12f在全基因组的特异性。尽管活性显著提高，工程化的AsCas12f保持了野生型AsCas12f系统较低的脱靶效应。
综上所述，该工作借助蛋白质工程化，结构分析，RNA工程化等手段开发出新的迷你基因编辑工具enAsCas12f，并揭示了AsCas12f系统的工作原理。enAsCas12f在显著提高野生型蛋白DNA编辑活性的同时保留了较高的特异性。作为迄今报道的最小型CRISPR系统之一，enAsCas12f将在基因编辑和基因治疗中具有广阔的应用前景。
参考文献
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【9】Takeda, S. N. et al. Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme. Mol. Cell 81, 558–570.e3 (2021).
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【11】Tsai, S. Q. et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat. Biotechnol. 33, 187–197 (2015).
https://www.nature.com/articles/s41589-023-01380-9
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