科学家提出基于物理模型的背景滤波方法，实现活细胞高保真成像，分辨率超过70nm

一直以来，由于光学衍射极限的制约，导致传统荧光显微成像技术的分辨率不够高，故难以清晰观察到细胞和生物分子的详细结构。

21 世纪以来，人们研发了各种超分辨率荧光显微技术。在这类技术之中，研究人员设法突破光学衍射极限，让显微镜的分辨率得以显著提升，借此得以深入地研究生物系统的微观结构和功能。

然而，本世纪初的超分辨率显微技术依然存在光毒性高、时间分辨率低、需要特殊荧光标记等问题。

例如，基于光激活定位显微技术/随机光学重建显微技术的超分辨率成像、以及基于受激发射损耗显微技术的超分辨率成像的光强，分别为 5×10³W/cm² 和 2×10⁷W/cm²。一旦存在光毒性高的问题，就会加速细胞的凋亡。

此外，秒级时间分辨率的缺点在于，会让人们无法有效观测到毫秒级胰岛素的分泌过程，进而限制着活细胞的观测应用。而当采用结构光超分辨率显微镜时，尽管它的光毒性比较低，时间分辨率也比较高，但在重建图像时容易产生伪影，故会影响信号的保真度。

过去十年以来，北京大学教授团队致力于解决超分辨率成像领域内的核心难题：即如何在提高成像的时空分辨率、消除噪声与伪影的同时，还能保持成像结构完整性？

2018 年，课题组在分析结构光超分辨率显微镜成像之后，首次指出该类显微镜在原始采集图像信噪比较低的时候，由于维纳逆滤波重建的存在，会导致内在重建伪迹的产生。

图 | 陈良怡（来源：）

基于此，该团队提出将生物信号的时空连续性先验知识用于构建海森矩阵，借此来指导图像的重建。结合课题组自主研发的硬件设备，比如控制系统、新偏振旋转玻片阵列等，他们造出了超灵敏海森结构光超分辨显微镜（Hessian-SIM，Hessian-structured illumination microscopy）。

这款显微镜可以大幅降低 85 纳米分辨率所需要的光照度，比常用的共聚焦显微镜的光照度低出三个数量级。利用 Hessian-SIM 可以在绿色荧光蛋白上实现通用活细胞的超分辨成像。

通过使用 Hessian-SIM，课题组也首次实现了活细胞的长时间超分辨率成像，其能以 1Hz 的频率连续成像 1 小时，而且全程没有漂白。

同样是借助 Hessian-SIM，他们还观察到了线粒体内嵴及其动态过程、囊泡分泌孔道、以及新中间态等活细胞里面的新结构和新动态。

不过，尽管结构光超分辨显微镜的时间分辨率，要高于光激活定位显微技术、随机光学重建显微技术、以及受激发射损耗显微技术，但是其空间分辨率仍然有所不足。

为进一步提高活细胞空间的分辨率，该团队将连续性、稀疏性、非负性的先验知识，融入计算机重建过程之中，借此提出了通用数学/计算超分辨率方法：稀疏解卷积法（Sparse Deconvolution）。

在各种显微镜模式之下，该方法均能突破硬件限制，进而提升空间分辨率。结合基于稀疏解卷积法的扫描离子显微镜（Sparse-SIM），课题组实现了分辨率约为 60nm 的活细胞超分辨率成像，帧速率高达 564Hz，比具备相近空间分辨率的其他超分辨率成像方法，高出了两个数量级。

解决时间分辨率和空间分辨率问题之后，课题组进一步提出新的问题：活细胞超分辨率成像是否能为生物学提供定量化洞见？

他们认为，要想实现基于这一目标的成像方法，需要满足以下四点要求：

其一，当不同实验者使用相同参数时，可以获得相同的结果；

其二，最小化地重建伪影和幻觉，以确保重建结构的准确性和可靠性；

其三，解决空间分辨率与荧光结构完整性之间的悖论，让高效超分辨方法在保持弱信号的同时，依然可以实现较高的分辨率；

其四，重建之后荧光信号的线性度必须保持不变，以便对荧光信号实现准确的定量化。

此外，该团队还发现尽管已经解决了“随机噪声会被放大成为随机伪影”的问题，但是在扫描离子显微镜重建的时候，离焦和背景信号会被错误地移动到高频位置，从而形成高频的周期性伪影，进而影响重建算法的保真度。

目前，在去除背景的时候，人们通常在频谱中使用陷波滤波器，借此滤除背景所对应的频谱，进而对背景和条纹伪影进行抑制。

但是，这需要根据人为经验来调整参数，而且会导致在重建信号强度的时候出现非线性的变化，甚至会错误地去除重建图像中的弱信号。

为解决这一问题，课题组从荧光显微成像的物理模型出发，进一步挖掘扫描离子显微镜成像过程中产生背景的本质原因，提出了基于“背景过滤——结构照明显微镜”的背景抑制算法 BF-SIM（Background Filtering-Scanning Ion Microscope）。

BF-SIM 可以根据系统硬件参数，来构建真实点的扩散函数，并能依据不同深度的点扩散函数，估算不同深度的背景荧光。

在使用中，该算法首先会去除原始数据中的背景信号，然后再进行扫描离子显微镜超分辨率的重建，借此起到背景抑制的作用。

（来源：Nature Communications）

由于是从物理成像模型推导而来，这让 BF-SIM 具有如下优点：1）具有更高的信号保真度，重建之中不会改变荧光信号的线性度；2）与传统滤波方法相比，BF-SIM 在抑制背景的同时，可以保留重建结果中的弱信号；3）BF-SIM 的参数由硬件系统确定，因此无需人为调节参数。

“以上这些工作，也是我们团队在超分辨成像领域探索十年之久的工作成果。”表示。

日前，关于 BF-SIM 的论文以《定量结构照明显微镜通过一个基于物理模型的背景滤波算法揭示了肌动蛋白动力学》（）为题发在 Nature Communications 上[1]。

MoYanquan 是第一作者，北京大学教授和重庆邮电大学教授担任共同通讯作者。

图 | 相关论文（来源：Nature Communications）

由于 BF-SIM 模型的假设，基于 z 轴照明一致的宽场成像，因此它不仅适用于 2D-SIM，还可以作为一种通用的背景抑制算法，以用于诸多荧光显微镜的成像重建之中。

例如，BF-SIM 可被插入到经典的 Wiener-SIM、Fair-SIM、Spare-SIM、DFCAN 和 TDV-SIM 等算法中，借此作为它们在重建过程之中的前置步骤，进而提高去除背景的能力。

当将 BF-SIM 与 Spare-SIM 结合之后，可以形成 BF-Spare-SIM 算法，该算法在实现数学/计算超分辨的同时，还能降低 Spare-SIM 重构信号的强度波动，进而保证结构的完整性，从而实现更加定量化的高保真重建。

此外，BF 模型还有望用于普通荧光显微镜、光片显微镜等。不过，相应的模型参数，则需要根据实际情况加以修改。

（来源：Nature Communications）

在 BF-SIM 这一课题中，其实他们最初并非为了解决背景问题，而是希望解决不同细胞器与胞质的不同折射率所导致的局部光学畸变和重建伪影的问题。

但是在推进原定课题的时候，背景问题尤为突出以至于频繁地干扰到实验进度。因此，他们决定先解决扫描离子显微镜背景伪影的问题。

“所以目前的研究结果也算是意外收获。事实上，我们的课题基本都来源于实验中遇到的困难，然后看看是否有合适的解决方案，如果没有特别理想的方案，就开始想办法寻找更好思路。”表示。

对于这一过程他打比喻称：即从确定性的目标出发，行进在不确定的“海洋”中，根据所得结果进行实时调整，这也是科学发现的常态。

同样是在 BF-SIM 这一课题中，做实验的时候还处于 2022 年的新冠疫情之中，那时北大校园经常处于封闭管理状态。

而组里负责培养细胞和做实验的同学，都在校外居住根本无法入校，这导致实验进度遭到停摆。

后来，他们只好将细胞和试剂邮寄到广州一家公司做实验。从北京邮寄细胞到广州，路程远、时间久、物流配送也不稳定，大家都非常担心细胞死了可咋办。

而且，此次邮寄的细胞非常珍贵，从北京邮寄出去的时候，没有来得及传代保存。后来，直到广州的实验成功之后，所有人才松了一口气。最终，也赶在期刊编辑要求的时间之内将实验补充完毕。

（来源：Nature Communications）

而由于不同细胞器与胞质具有不同的折射率，这会导致局部的光学畸变和重建伪影。这让低信噪比图像的高保真无幻觉重建，成为领域内的另一个挑战。

因此，课题组后续可能会从像差和噪声的角度出发，继续致力于在提高时空分辨率的同时，保持成像结构完整性，以及实现厚样本的最小化伪影成像。

此外，补充称：“与测序结果不同的是，生物成像数据本身并没有所谓的绝对‘真实’图像。因此，SIM 也不例外。在实验中，总会出现各种不符合标准成像模型的因素，这可能会导致计算误差并产生重建伪影。”

无论是维纳解卷积的结果，还是其他优化正则化的结果，它们都只是近似值，这让人们无法获得绝对真实的图像。

然而，在当前这种合理且可控的条件下，近似结果也是可以接受的。虽然此次研究尚未完全解决 SIM 重建伪影的问题，但通过不断优化方法可以使其更加接近真实图像。

另一方面，当我们使用新方法去发现新现象时，如何确定它们是真实的？实际上，这个答案与科研探索是相似的。

新的发现，需要其他成像以及非成像方法的交叉验证。只有当多个证据都指向同一个方向，才能认为这是一个相对可靠的发现。总之，时间终将证明或证伪一切。

（来源：Nature Communications）

十年之间，团队达成了多项超分辨率显微技术成果。在科研“织田”的同时，他也担任多项要职。

除在北大任职之外，还是北京大学麦戈文脑研究所、、北京市协同创新研究院的兼职研究员，并担任多模态跨尺度生物医学成像设施装置 II 的负责人、以及多模态跨尺度生物医学成像设施组织所举办的怀柔论坛的主要负责人。

而在北京大学国家生物医学成像科学中心，他还负责吸引、面试和招收年轻 PI，并和他们一起承担建设“怀柔设施”的艰巨任务。

参考资料：

1.Mo, Y., Wang, K., Li, L. et al. Quantitative structured illumination microscopy via a physical model-based background filtering algorithm reveals actin dynamics. Nat Commun 14, 3089 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38808-8

运营/排版：何晨龙

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