Molecular Cell | 一种高通量二硫键扫描方法，系统探究蛋白构型变化决定表型的机制

撰文 | 存中一贯

蛋白质能量景观 （Protein energy landscapes） 是非常多变的，这意味着一种蛋白质分子可能存在许多不同的构象。固有无序蛋白（Intrinsically disordered proteins,IDPs） 具有许多不同的构象，并在生理上具有不同的功能和表型【1-3】。蛋白质在生物体内的构象组装与体外是完全不同的。错误折叠的蛋白构象在体内具有毒性【4】，但这种毒性的生物物理学机制还未阐释清楚。

二硫键是蛋白序列中构象形成的关键因素之一，二硫键异构酶 （disulfide isomerases） 能够水解对蛋白构象不利的二硫键【5】。二硫键扫描突变是一种较为完善的研究二硫键结构模型的方法【6】，然而，双半胱氨酸变体（double-Cys variant）的数量与多肽长度的平方成正比，这使得扫描整个蛋白质变得很难实现。

2023年6月1日，来自美国哈佛大学的Eugene I. Shakhnovich带领团队在Molecular Cell发表了Systematic conformation-to-phenotype mapping via limited deep sequencing of proteins的研究，他们建立了一种高通量二硫键扫描方法（high-throughput disulfide scanning, HTDS），并利用此方法对大肠杆菌中的IDP蛋白HdeA的构型以及功能进行了检测，对HdeA蛋白各种二硫键变体引起的构型变化和细胞毒性进行了详细的研究。

HdeA是大肠杆菌中的一个分子伴侣，它能在酸性条件下抑制周质蛋白的聚集，同时，在酸性条件下，HdeA保持无序状态，但是在中性pH条件下，它具有一个折叠的二聚体核心和一个无序的N端结构域。野生HdeA中仅含有两个Cys残基 （分别在第18位和66位） ，它们之间形成一个保守的二硫键，这个二硫键的消失会导致HdeA结构的无序化，并抑制其分子伴侣功能。

研究人员以HdeA的C18S/C66S双突变菌株 （标记为“noC”，即没有Cys） 为背景构建了双半胱氨酸突变菌株库，即随机选择两个氨基酸突变为Cys，其它氨基酸序列不变，并以此变体库为材料进行后续实验检测。HTDS是利用氰化氨解化学 （cyanylation-aminolysis chemistry） 在二硫键的两个Cys位置分别切开多肽链，将多肽链分解为3段，然后通过MS/MS分析中间段多肽片段，以确定Cys在整个蛋白质序列中的位置。

研究人员首先选择了11个变体菌株的生长曲线，包括野生型WT和noC菌株，发现除WT菌株外，其他所有变体菌株的生长曲线有所下调，说明这些变体的表达对于菌株具有不同程度的毒性。分别检测菌体以及上清里蛋白表达水平，发现WT的上清里只有HdeA的存在，而没有其他蛋白，说明HdeA分泌到上清里不是因为菌体细胞裂解造成的，而其他突变株的上清液中有其它蛋白的存在，说明这些突变株发生了菌株裂解，同时也解释了突变株生长曲线下降的原因。另外，在突变株中也同时检测到了另一个分子伴侣DnaK的表达，这说明，HdeA变体毒性在宿主细胞中引起了蛋白质错误折叠压力应激。

接下来，研究人员继续探究了突变体对菌株毒性的影响，发现两个半胱氨酸之间的距离与突变株的毒性相关。野生型WT的两个半胱氨酸18/66没有毒性，之后毒性最小的位置是17/66，18/65和18/67的毒性比noC菌株毒性更强，半胱氨酸位置的移动都会引起细胞毒性的增强。

研究人员检测了突变株中突变HdeA的蛋白表达水平，在1453个毒性突变株中，理论上有1154个蛋白能够检测到，但实际仅有446个检测到了蛋白水平表达，其中284个表达在周质蛋白，339个表达在菌株外上清中 （177个也在周质蛋白表达） ，这些突变株蛋白表达水平的差异可能和DNA水平等位基因丰度、表达水平、蛋白的定位以及电离度相关。

最后，研究人员利用他们开发的MCPU （Monte Carlo protein unfolding） 方法对突变体的蛋白结构进行了模拟，发现一些双半胱氨酸突变体相比noC突变体，具有更多的解离的、微小团簇或者非团簇构象。这些双半胱氨酸突变体通过形成二硫键促进了蛋白的无序化，最终导致细胞毒性的增加。同时，研究人员还发现，突变株的毒性和其疏水性密切相关，疏水性越强，其细胞毒性越强。

总之，本研究建立了一种高通量二硫键扫描方法，应用此方法，研究人员对大肠杆菌中分子伴侣HdeA的构象变化进行了检测，为理解蛋白质能级与蛋白质构象之间的联系以及蛋白质构象和生理表型之间的联系奠定了基础。

参考文献

1. Uversky, V.N. (2019). Intrinsically disordered proteins and their ‘‘mysterious’’ (meta)physics.Front. Phys.7. 18, 10.

2. Porter, L.L., and Looger, L.L. (2018). Extant fold-switching proteins are widespread.Proc. Natl. Acad. Sci.USA 115, 5968–5973.

3. Brockwell, D.J., and Radford, S.E. (2007). Intermediates: ubiquitous species on folding energy landscapes?Curr. Opin. Struct. Biol.17, 30–37.

4. Wu, Z.X., Cai, X.J., Zhang, X., Liu, Y., Tian, G.B., Yang, J.R., and Chen, X.S. (2022). Expression level is a major modifier of the fitness landscape of a protein coding gene.Nat. Ecol. Evol.6, 103–115.

5. Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Feng, J., Kaplan, A., Ingle´ s-Prieto, A., Badilla, C.L., Stockwell, B.R., Sanchez-Ruiz, J.M., Holmgren, A., and Ferna´ ndez, J.M. (2012). Protein folding drives disulfide formation.Cell151, 794–806.

6. Butler, S.L., and Falke, J.J. (1998). Cysteine and disulfide scanning reveals two amphiphilic helices in the linker region of the aspartate chemoreceptor.Biochemistry37, 10746–10756.

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.05.006