《AM》：梯度水凝胶构建“肠道菌群”三维体外模型

*仅供医学专业人士阅读参考

尽管已经认识到肠道微生物群在癌症化疗中起着重要作用，但对机制的理解和转化研究仍然有限。最大限度提高药物疗效需要深入了解微生物群是如何促进反应，而微生物群的调控则因人体的复杂性而受到阻碍。

本文为了解决这个问题，开发了工程微生物群（EM）三维实验模型，用于连接微生物群与药物相互作用研究和治疗决策。EM可以在体外操作，再现人类肠道微生物群的属/种水平，同时允许与细胞、器官和分离的组织共同培养以测试药物反应。通过EM对各种临床和实验药物的检查显示，肠道微生物群通过三种途径影响药物的疗效：免疫学效应、生物累积和药物代谢。在所发现的机制的指导下，采取定制策略，最大限度提高药物对具有患者衍生肠道微生物群正位肿瘤模型的治疗效果。策略包括免疫协同作用、纳米粒子封装和宿主-宿主复合物的形成。鉴于肠道微生物群在影响药物疗效方面的重要作用，EM将可能成为指导药物转化和临床决策的一个不可或缺的工具。

图1 EM构建

本文通过旋涂和光诱导聚合制备多层水凝胶。逐层得到多层水凝胶，具有粘蛋白-聚（4-苯乙烯磺酸钠（PSS））-聚（乙二醇）二丙烯（PEGDA）-肠道细菌和聚烯丙基胺氢氯化物（PAH）-PEGDA的区间排列。PAH和PSS电荷相反，保持了分层结构稳定性。粘液蛋白促进细菌生长，而PAH阻止细菌穿过界面。肠道细菌的种类组成可以根据每层营养物质和代谢物的独特浓度而转变。扫描电子显微镜（SEM）图像证明多层水凝胶的组装。荧光成像进一步表明细菌和水凝胶的共同存在。多层水凝胶的层数、厚度和形状是完全可调的。接着研究了多层水凝胶中的异质性环境。在469个确定的化合物中，42.4%的化合物从上到下逐渐增加，16.7%的化合物减少。营养物质逐渐减少，而细菌的代谢物从顶部到底部增加，表明多层水凝胶中物质浓度梯度。此外，由于产酸和耗氧的肠道菌群，多层水凝胶也形成了pH值和氧气的浓度梯度。模拟了一个类似于肠道的异质环境，并有望在体外形成一个工程微生物群（EM）系统。

图2 EM的分类构成

对EM进行了16S测序，并将其与液体培养的群落（LCC）和水凝胶包裹的群落（HEC）进行比较，这是最常用的研究肠道微生物群的模型。志贺氏埃希氏菌的丰度增加到总细菌的35%，而巴氏杆菌和穆氏杆菌则减少了3.2倍和129倍。同样，一些细菌属的丰度也随着HEC的干预而改变，如乳酸菌、异戊二烯菌和穆里巴拉菌科。相比之下，EM保持了肠道微生物群的平衡。肠道微生物群的多样性和EM（ACE指数=198）是相当的。多变量方差分析显示，EM和肠道微生物群在属或种的水平上没有显著差异。EM与肠道微生物群高度相似的分类组成很容易重复。此外，收集结肠癌患者的粪便样本来构建人源化的EM。虽然人类肠道微生物群与小鼠的微生物群存在个体差异，但EM在很大程度上保留了不同患者的肠道微生物群的独特特征。培养HEC或LCC后，肠道微生物群中的21属和71属分别发生明显变化。相比之下，EM显示肠道微生物群的丰度没有明显差异，EM的功能与体内的肠道微生物群高度相似。使用荧光原位杂交（FISH）探针来标记EM中的细菌。正如预期的那样，具有不同代谢特征的细菌在水凝胶中呈异质性分布。即使在有氧条件下，EM也支持厌氧肠道细菌的生长。

图3 宿主成分与EM共同培养

为研究在微生物群影响下药物对宿主的影响，有必要将EM与宿主细胞共同培养。EM对细胞的影响从六个方面进行评估：原蛋白合成、膜通透性、酶活性、抗基因呈现、细胞运动和细胞形态。EM对细胞蛋白质合成影响在表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的细胞上得到验证。LCC处理使EGFP-HEK293细胞的荧光强度降低了26.6%。此外，膜渗透性碘化丙啶（PI）的内化在LCC处理后增加了2倍。在用HEC处理的细胞中，膜通透性略有增加。相比之下，EM处理没有增加PI的吸收，表明细胞膜通透性没有受到影响。LCC和HEC提高了树突状细胞呈现卵清蛋白表位的能力，可能是由于细菌过度生长和肠道功能失调引起的促炎症效应。相比之下，EM处理对细胞的这些特性显示出消极的影响。通过将EM与分离的肠道组织共同培养来评估体外的生物相容性。肠道组织仍然保持着新鲜肠道的形态结构，因为肠道绒毛被粘液蛋白（Muc-2）覆盖。E-cad和PCNA免疫荧光也显示EM并不影响肠道细胞的增殖。然而，LCC引起肠道炎症，如CD45+免疫细胞和炎症因子Il-10的增加。

图4 药物效果验证

图5 优化治疗方案

本文通过逐层光聚合方法开发了一种多层水凝胶。多层水凝胶具有异质性环境，在体外能稳定保持复杂的肠道微生物群的分类组成。利用这个模型，研究肠道微生物群对常用抗癌药物疗效的影响。在药物筛选试验中，发现肠道微生物群通过三种途径影响药物的疗效：1）免疫作用，2）生物积累，3）药物代谢。对该机制的深入了解进一步指导了实验药物和商业制剂的优化。在综合考虑肠道微生物群的情况下，进一步改进米托蒽醌、CI1040、奥沙利铂的治疗方案。这些优化的治疗药物在肿瘤模型中显示出优越的效果。