人体mRNA解码比细菌慢的分子机制解析

撰文 | 存中一贯

在所有物种中，核糖体合成蛋白质都是通过高保真的解码mRNA核苷酸序列来实现的。当前我们关于解码机制的认识主要来自于对细菌系统的研究。尽管解码相关生物学特征在不同物种中都是高度保守的，但真核生物中蛋白翻译的保真度要高于细菌【1】。在人体中，信使RNA的解码保真度与衰老和疾病密切相关，这个过程可作为病毒感染以及癌症治疗的干预靶点【2】。

将mRNA密码子翻译成蛋白序列涉及大核糖体的两个亚基的相互作用，核糖体大亚基（large ribosomal subunits,LSU）和核糖体小亚基（small ribosomal subunit,SSU）在不同物种的进化中是高度保守的，这种保守性为核糖体与多种结构类似但序列不同的氨酰-tRNA（aa-tRNA）进行快速准确的相互作用奠定了基础。

在细菌中进行的广泛的生化、动力学和结构研究工作显示，信使RNA的解码主要依赖于两步动力学校对机制，即起始选择（initial selection）和校对选择（proofreading selection）【3】。在细菌中，起始选择以aa-tRNA、GTP和延伸因子EF-Tu（thermal unstable）组成三元复合物为起点，此三元复合物将mRNA密码子引导至核糖体边缘的氨酰位点（aminoacyl site, A site）。在解码中心（decoding centre），mRNA密码子与aa-tRNA上的反义密码子茎环（anticodon stem loop, ASL）配对结合，并被rRNA和蛋白质组成的小亚基复合物进行校对检验。对同源aa-tRNA的正确识别导致了SSU肩部结构域向体部和头部结构域的关闭。接下来，三元复合物参与LSU的GTP酶活化中心（GTPase-activating center, GAC）反应，诱导GTP酶的重排，激活GTP水解【4】。

GTP水解起始了第二步的校对选择，在这一过程中，携带着氨基酸的aa-tRNA进入大亚基的肽酰转移酶中心（peptidyl transferase center, PTC），肽键的形成将新生肽链P位点中的tRNA上转移到aa-tRNA。肽键的形成标志着解码的终止，产生了PRE复合物（pre-translocation）。解码的保真度主要通过两个校对机制实现，分别在GTP水解之前的起始选择和之后的校对选择中拒绝不正确的aa-tRNA与密码子的配对。近期，一些结构研究对哺乳动物翻译的翻译过程有了更深入的了解，与细菌中不同的是，一些亚基在翻译过程中发生了滚动（rolling），这是细菌中不存在的分子机制【5-6】。哺乳动物中这些构型变化以及真核生物翻译过程中一些特有的过程怎么促进了翻译的保真度，目前还是未知的。

近日，来自美国St Jude Children’s Research Hospital的Scott C. Blanchard团队在Nature发表了他们最新的研究成果，题目是mRNA decoding in human is kinetically and structurally distinct from bacteria，他们通过单分子FRET、冷冻电镜等技术对真核生物核糖体解码mRNA的过程进行了详细的探究，发现了真核生物中翻译速度比细菌中慢，但翻译保真度高的分子机制。

研究人员采用单分子FRET（smFRET）成像对真核生物的核糖体解码过程进行了体外研究。研究人员利用纯化的人体核糖体亚基和起始因子Met-tRNAfMet构建了一个体外系统，在这个体系中，研究人员使eIF5A占据核糖体的E位点，荧光受体（LD655）标记的Phe-tRNAPhe与eEF1A和GTP组成起始复合物（initiation complexes, ICs），荧光供体（Cy3）标记的Met-tRNAfMet占据P位点。在此体系中，smFRET检测到3个明显的FRET信号（FRET=0.23±0.09， 0.49±0.13和0.74±0.06）。这个结果表明，根据aa-tRNA和P位点的距离，在解码过程中核糖体构象至少存在4个保守的形式，包括2个三元复合体结合的中间态。这4个构象变化的过程可以总结为：1，IC阶段（Initiation complex），还没有占据A位点；2，CR阶段（Codon recognition），三元复合体结合到SSU的A位点，但还未与LSU接触；3，GA阶段（GTPase activated），三元复合体结合到SSU，且与LSU的GTP酶激活中心（GAC）接触；4，AC阶段（Accommodated），eEF1A解离，A位点的tRNA完全进入肽基转移酶中心（PTC），如图1。

图1 单分子FRET实验

根据上述实验结果，研究人员还分析了三元复合体结合人体核糖体的生物分子速率约为70±6μΜ-1S-1，tRNA进入P位点形成PRE复合体的催化效率约为43±3μΜ-1S-1。人体中三元复合体的结合速率比细菌中慢2倍左右，中间态向高效FRET转变的速率比细菌中慢10倍左右。进一步的研究显示，校对选择是人体中这一过程的限速反应。

接下来，研究人员通过冷冻电镜解析了4个不同阶段的复合物结构（IC, CR, GA, AC），复合物的平均分辨率为2.3-2.9埃。结构信息显示，真核生物特有的核糖体蛋白eL42和uL5位于LSU的中央部位，关闭了E位点。与细菌中不同的是，SSU头部结构域中4个额外的蛋白尾部延伸到了A位点（eS31）和P位点（uS13, uS19和eS25），后面3个蛋白直接与P位点的tRNA存在相互作用。

研究人员通过smFRET实验发现，在起始选择阶段aa-tRNA的肘部结构域向P位点移动了约7埃，在校对选择阶段，aa-tRNA的肘部结构域又向P位点移动了约26埃，这种移动在细菌中是不存在的，可能是真核生物或者哺乳动物特有的。

结构信息还显示，细菌的CR结构中，eEF1A的domain II和SSU肩部结构域中的h5（helix 5）存在相互作用，而eEF1A的domain III则和uS12的C端存在相互作用。在人的核糖体中，这些CR复合体还通过另外一个相互作用维持其特征，即SSU肩部结构域的h14和真核生物特有的α2螺旋之间的相互作用，这在细菌中是不存在的，因为细菌中没有α2螺旋。

除了以上特征之外，研究人员还发现，人核糖体的解码中心与GTP酶的活化都与细菌中存在许多差别，在校正选择阶段aa-tRNA通过滚动向LSU移动了4埃的距离，而在细菌中，校正选择阶段不存在aa-tRNA的滚动。SSU的滚动压紧了A位点的亚空间，关闭了之前eEF1A分别在SSU和LSU上的连接点。SSU的滚动也促进了核糖体前缘和后缘的变构通讯。

总之，本研究对真核生物尤其是人核糖体解码信使RNA的过程进行了详细的分子机制探寻，发现了人体中解码保真性高但速度慢的具体原因，对真核生物的翻译过程有了全新的理解。

https://doi.org/10.1038/s41586-023-05908-w

制版人：十一

参考文献

1. Kramer, E. B., Vallabhaneni, H., Mayer, L. M. & Farabaugh, P. J. A comprehensive analysis of translational missense errors in the yeast Saccharomyces cerevisiae.RNA16, 1797–1808 (2010).

2. Welch, E. M. et al. PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.Nature447, 87–91 (2007).

3. Geggier, P. et al. Conformational sampling of aminoacyl-tRNA during selection on the bacterial ribosome.J. Mol. Biol.399, 576–595 (2010).

4. Blanchard, S. C., Gonzalez, R. L., Kim, H. D., Chu, S. & Puglisi, J. D. tRNA selection and kinetic proofreading in translation.Nat. Struct. Mol. Biol.11, 1008–1014 (2004).

5. Behrmann, E. et al. Structural snapshots of actively translating human ribosomes.Cell161, 845–857 (2015).

6. Budkevich, T. V. et al. Regulation of the mammalian elongation cycle by subunit rolling: a eukaryotic-specific ribosome rearrangement.Cell158, 121–131 (2014).