湖南中医药大学-麻杏石甘汤-外泌体miR-1249-5p-流感病毒

流行性感冒（简称流感）是一种由流感病毒引起的急性呼吸道疾病，以具有高度传染性、传播性和易于变异的甲型流感病毒（ influenza A virus ， IAV ）为主 [1-3] 。每年因 IAV 引起的呼吸道疾病死亡的人数多达 65 万例，对社会经济和人类健康造成了巨大的负担。肺作为气体交换的主要器官，含有先天性和适应性免疫细胞，当机体感染 IAV 时能够诱导强大的免疫反应 [4] 。肺上皮细胞作为肺泡中病原体防御的第一道防线，是肺损伤过程中被损伤的初始部位 [5] ，也是成为推动肺部疾病进展的一大动力。肺泡巨噬细胞（ alveolar macrophage ， AMΦ ）位于肺实质内，是肺组织中的主要免疫细胞，在病毒清除和免疫调节中扮演着关键角色。并且与肺上皮细胞相比，在 IAV 感染期间 AMΦ 的感染效率很低， AMΦ 会向 M1 型极化转化，促进炎症细胞因子的分泌，导致肺组织中性粒细胞浸润和组织损伤 [6] 。外泌体是一种由宿主细胞分泌的细胞外囊泡，因其在机体生理病理活动中的细胞通讯作用日益被关注。本课题组前期研究发现， IAV 可以引起肺上皮细胞源外泌体 miRNA 差异表达，通过外泌体 miR-1249-5p 靶向调节溶质载体家族 4 成员 A1 （ solute carrier family 4 member 1 ， SLC4A1 ）基因抑制核因子 -κB （ nuclear factor-κB ， NF-κB ）信号通路，从而参与肺炎和功能障碍的过程 [7-8] 。

麻杏石甘汤出自中医经典著作《伤寒论》，由麻黄、杏仁、石膏和甘草 4 味药组成，有辛凉宣泄、清肺平喘之功效，广泛用于流感性感冒之风寒郁而化热或外感风热的治疗，联合化学药可治疗支原体肺炎 [9] 。课题组前期研究表明麻杏石甘汤能够通过调节细胞因子的分泌、调控炎性相关信号传导途径、抑制 IAV 诱导的损伤效应，发挥抗 IAV 的作用 [10-11] ， 基于前期研究，采用麻杏石甘汤治疗后的肺上皮细胞源外泌体，赋予肺上皮细胞源外泌体药物治疗功能，探讨功能性外泌体调控巨噬细胞极化以及对麻杏石甘汤抗 IAV 的作用机制。

1 材料

1.1 细胞、病毒株和动物

小鼠肺上皮 MLE-12 细胞为本实验室传代保存， RAW246.7 肺泡巨噬细胞株来自中科院细胞库。

流感病毒小鼠肺适应株（ A 型， IAV ， A/PR/8/34 ）为湖南师范大学病毒研究室惠赠。经 10 日龄鸡胚尿囊腔接种培养传代，血凝效价 1 ∶ 640 以上者供实验用。将病毒尿囊液以灭菌生理盐水稀释成每 0.1 毫升 50 LD50 [ 感染复数（ multiplicity of infection ， MOI ＝ 0.1 ） ] 置于冰袋中备用。

1.2 动物

SPF 级 雄性 SD 大鼠 24 只， 6 ～ 8 周龄，体质量 220 ～ 250 g ，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，质量 合格证号 ZS-202110120005 。动物 饲养于湖南中医药大学动物实验中心，动物 实验经湖南中医药大学动物实验中心伦理委员会批准（批准号 LL2021101202 ）。

1.3 药材

麻杏石甘汤由麻黄 9 g （批号 2004060 ）、杏仁 9 g （批号 2020120302 ）、石膏 18g （批号 2008090062 ）和炙甘草 6 g （批号 201003 ）组成，以上药材均购自湖南中医药大学第一附属医院，由湖南中医药大学药学院戴冰教授鉴定分别为麻黄科植物麻黄 Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Mey. 的干燥草质茎、蔷薇科植物山杏 Prunus armeniaca L. var. ansu Maxim. 的干燥成熟种子、硫酸盐类矿物石膏族石膏、豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的干燥根和根茎，均符合《中国药典》 2020 年版规定。

1.4 药品与试剂

RPMI 1640 基础培养液（批号 WF0021F221 ）、 DMEM 基础培养液（批号 WH0021D031 ）、无外泌体培养液（批号 PB180438 ）、 PBS （批号 WH0021D081 ）、无血清非程序冻存液（批号 WH0021A081 ）、双抗（批号 WH1021A161 ）均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清（批号 SA210518 ）购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；病毒稀释液 [ 含 RPMI 1640 基础培养液、 1 mol/L HEPES （批号 WH01111711SP ）、 1 mg/mL TPCK-Try 、 NaHCO3 、双抗 ] 、病毒维持液（含 0.2% 胎牛血清的病毒稀释液）、磷酸奥司他韦（批号 HY-17016 ）购自 MCE 公司； CCK-8 细胞增殖毒性检测试剂盒（批号 BS350A ）购自 Biosharp 公司； miRNA 逆转录引物购自上海生工生物工程有限公司；白细胞介素 -6 （ interleukin-6 ， IL-6 ）抗体（批号 DF6087 ）购自 Affinity 公司； IL-1β 抗体（批号 ab79559 ）购自英国 Abcam 公司；肿瘤坏死因子 -α （ tumor necrosis factor-α ， TNF-α ）抗体（批号 17590-1-AP ）购自 Proteintech 公司； NF-κB 抗体（批号 bs-0465R ）、 β-actin 抗体（批号 AG07197903 ）购自 BIOSS 公司； SLC4A1 抗体（批号 23276S ）购自美国 CST 公司；二抗 （批号 E-AB-1003 ）购自 Elabscience 公司。

1.5 仪器

流式细胞仪、 Optima MAX-XP 型台式超速离心机（美国 Beckman Coulter 公司）； 3111 型 CO2 细胞培养箱（美国 Thermo 公司）； Western blotting 工作系统、 CFX Touch 荧光定量 PCR 仪（美国 Bio-Rad 公司）； ELX800 型酶标仪（美国 Bio-Tek 公司）； NS300 型马尔文纳米颗粒跟踪分析仪（英国马尔文仪器公司）。

2 方法

2.1 麻杏石甘汤含药血清的制备

2.1.1麻杏石甘汤水煎剂的制备 根据《方剂学》中麻杏石甘汤的药物组成、剂量及煎煮方法制备水煎剂，按动物体表面积剂量换算法，根据《方剂学》和《中药药理学》，采用表面积剂量换算法，制备 5 倍临床等效剂量的麻杏石甘汤煎剂。按照中药比例称取 1 剂的药材量，加入 10 倍体积蒸馏水浸泡 20 min ，武火煮沸后文火煎煮 30 min ，煎煮后滤过，二煎加入 7 倍体积蒸馏水，同样方式煎煮完毕后，合并 2 次滤过液，水浴浓缩至含生药 3.8 g/mL 。

2.1.2含药血清的制备 SD 大鼠随机分为对照组和麻杏石甘汤组，每组 10 只。麻杏石甘汤组 ig 药物，对照组 ig 等体积蒸馏水， 1 次 /d ，每次 4 mL ，连续 7 d ，在末次给药 2 h 后对大鼠进行麻醉固定，腹主动脉采血，在 4 ℃ 冰箱内静置 2 h ， 3000 r/min 离心 10 min ，收集血清，得到麻杏石甘汤含药血清和空白对照血清，同组血清混合后 56 ℃ 灭活，用 0.22 μm 微孔滤膜滤过除菌后分装， − 20 ℃ 保存备用。通过超高液相色谱法检测麻杏石甘汤含药血清中的麻黄碱和甘草酸的质量浓度分别为 0.592 、 0.276 mg/mL 。

2.2 细胞培养

MLE-12 和 RAW246.7 细胞用 10% 胎牛血清、 1% 双抗、 90% 基础培养液，于 37 ℃、 5% CO2 的培养箱中培养，每天更换细胞培养液，当细胞生长至培养瓶 90% 时，用 0.25% 胰蛋白酶进行消化、传代。

2.3CCK-8检测细胞活性

2.3.1麻杏石甘汤含药血清对正常肺上皮细胞活性的影响 MLE-12 细胞以 4000 个 / 孔接种至 96 孔板，分别用 80% 、 40% 、 20% 、 10% 的麻杏石甘汤含药血清以及空白血清干预 24 h 。加入 CCK-8 试剂，测定 450 nm 波长处的吸光度（ A ）值，计算细胞抑制率。

细胞抑制率＝ 1 － A 实验 /A 对照

2.3.2麻杏石甘汤含药血清对 IAV 感染的肺上皮细胞活性的影响 MLE-12 细胞以 4000 个 / 孔接种至 96 孔板，以 IAV 干预细胞 2 h ，再分别用 80% 、 40% 、 20% 、 10% 的麻杏石甘汤含药血清以及空白血清干预 8 h 。加入 CCK-8 试剂，测定 450 nm 波长处的 A 值，计算细胞存活率。

细胞存活率＝ A 实验 /A 对照

2.4 功能性外泌体的获取

将 MLE-12 细胞设置对照组、模型组及麻杏石甘汤含药血清低、高剂量（ 10% 、 20% ）组和奥司他韦（ 5 μmol/mL ）组，待细胞长至 90% 时，在 IAV 刺激 2 h 后，对照组和模型组加入空白含药血清，各给药组加入相应药物。处理 8 h 后，收集各组细胞上清液，通过差速超高速离心提取物为功能性外泌体样本。

2.5 纳米颗粒跟踪分析

将获取的各组功能性外泌体沉淀加入 1 mL PBS 重悬混匀后，在比色皿中加入 0.2 mL 外泌体悬液，使用 BT-Zeta100 纳米粒度及 Zeta 电位分析仪，通过 Origin 2021 软件分析实验数据。

2.6BCA检测外泌体浓度

将获取的各组功能性外泌体加入 1 mL PBS 重悬，根据 BCA 试剂盒说明书，在 96 孔板中每孔加入 20 μL 悬液，每组 3 个复孔，加入 BCA 工作液， 37 ℃孵育 30 min ，检测 562 nm 波长处的 A 值，计算各组功能性外泌体浓度。

2.7 功能性外泌体与巨噬细胞共培养

将巨噬细胞以 1 × 106 个 / 孔接种至 6 孔板中，待细胞贴壁后，取“ 2.4 ”项下收集的肺上皮细胞源外泌体加入 1 mL 基础培养液重悬，将各组功能性外泌体分别与巨噬细胞共培养 24 h ， 250 μL/ 孔，设置对照组（ EVs-Con ）、模型组（ EVs-Model ）、麻杏石甘汤含药血清低剂量组（ EVs-LD ）、麻杏石甘汤含药血清高剂量组（ EVs-HD ）、奥司他韦组（ EVs-OS ），于 24 h 后收集巨噬细胞，待后续检测。

2.8 qRT-PCR检测 功能性外泌体miR-1249-5p mRNA及巨噬细胞miR-1249-5p、SLC4A1、NF-κB、IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β1mRNA表达

取“ 2.4 ”项下提取的功能性外泌体，按照试剂盒说明书提取外泌体中总 RNA 并合成 cDNA ，进行 qRT-PCR 分析，检测外泌体 miR-1249-5p 基因表达水平。

按“ 2.7 ”项下方法处理细胞，收集各组巨噬细胞，预冷的 PBS 清洗 2 遍，按照试剂盒说明书提取巨噬细胞中总 RNA 并合成 cDNA ，进行 qRT-qPCR 分析，检测巨噬细胞中 miR-1249-5p 、 SLC4A1 、 NF-κB 、 IL-6 、 IL-1 β 、 TNF-α 、 IL-10 、 TGF-β1 基因表达水平。引物序列见表 1 。

2.9Western blotting检测 巨噬细胞SLC4A1、NF-κB、IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表达

按“ 2.7 ”项下方法处理细胞，收集各组巨噬细胞，加入 RIPA 裂解液提取总蛋白，用 BCA 试剂盒检测总蛋白浓度，高温变性后蛋白样品经 10% 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至 PVDF 膜，用 1 × TBST 洗涤，加入 5% 牛血清白蛋白， 37 ℃封闭 2 h ，用 1 × TBST 洗涤，加入一抗， 4 ℃孵育过夜，用 1 × TBST 洗涤，加入二抗，室温孵育 2 h 。 ECL 显影曝光后采用化学发光仪检测并分析。

2.10 流式细胞术检测巨噬细胞M1/M2分型

按“ 2.7 ”项下方法处理细胞，收集各组巨噬细胞，用预冷的 PBS 清洗 2 遍，制备成 5 × 106 个 /mL 的细胞悬液，采用流式细胞仪检测巨噬细胞 M1/M2 分型。

2.11 统计学分析

运用 SPSS 21.0 统计软件进行处理数据，计量资料经检验符合正态分布，方差齐性，以 表示，两组间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用 One-way ANOVA 检测。

3结果

3.1 麻杏石甘汤含药血清对正常肺上皮细胞活性的影响

如表 2 所示，与对照组比较， 80% 、 40% 麻杏石甘汤含药血清干预后，肺上皮细胞活性均显著降低（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）， 20% 、 10% 的含药血清组对肺上皮细胞活性无明显影响。

3.2 麻杏石甘汤含药血清对IAV感染的肺上皮细胞活性的影响

如表 3 所示，与对照组比较，模型组肺上皮细胞活性显著下降（ P ＜ 0.001 ）；与模型组比较， 10% 、 20% 、 40% 含药血清组细胞活性明显增加（ P ＜ 0.05 、 0.01 、 0.001 ）， 80% 的含药血清抑制细胞增殖。综合以上 2 个实验结果，选取 20% 和 10% 的含药血清进行后续实验。

3.3 功能性外泌体鉴定

使用纳米颗粒追踪分析技术确定外泌体大小，如图 1 所示，外泌体大小均一，粒径均为 50 ～ 100 nm ，无明显差异。 BCA 法对各组功能性外泌体总蛋白浓度进行检测，结果见图 2 ，表明不同干预因素会影响外泌体的分泌，所以后续实验决定采用同体积的外泌体干预巨噬细胞。

3.4 功能性外泌体中miR-1249-5p基因表达

如图 3 所示，与对照组比较，模型组外泌体 miR-1249-5p mRNA 表达水平显著下降（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，各给药组外泌体 miR-1249-5p mRNA 表达水平明显增加（ P ＜ 0.05 、 0.001 ），而含药血清低 剂量组 miR-1249-5p mRNA 表达水平高于含药血清高剂量组和奥司他韦组。

3.5 功能性外泌体对巨噬细胞miR-1249-5p基因表达的影响

如图 4 所示，与 EVs-Con 组比较， EVs-Model 组巨噬细胞 miR-1249-5p mRNA 表达水平显著降低（ P ＜ 0.001 ）；与 EVs-Model 组比较，各给药组巨噬细胞 miR-1249-5p mRNA 表达水平明显增加（ P ＜ 0.05 、 0.001 ）， EVs-LD 组 miR-1249-5p mRNA 表达水平高于 EVs-HD 和 EVs-OS 组。

3.6 功能性外泌体对巨噬细胞SLC4A1、NF-κB、IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表达的影响

如图 5 所示，与 EVs-Con 组比较， EVs-Model 组巨噬细胞中 SLC4A1 、 NF-κB 、 IL-6 、 IL-1β 和 TNF-α mRNA 表达水平均显著升高（ P ＜ 0.01 、 0.001 ）；与 EVs-Model 组比较，各给药组巨噬细胞中 SLC4A1 、 IL-6 、 IL-1β 和 TNF-α mRNA 表达水平均显著降低（ P ＜ 0.05 、 0.01 、 0.001 ）， EVs-HD 组、 EVs-OS 组巨噬细胞中 NF-κB mRNA 表达水平显著降低（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）。

3.7 功能性外泌体对巨噬细胞SLC4A1、NF-κB、IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表达的影响

如图 6 所示，与 EVs-Con 组比较， EVs-Model 组巨噬细胞中 SLC4A1 、 NF-κB 、 IL-6 、 IL-1β 和 TNF-α 蛋白表达水平均显著升高（ P ＜ 0.01 ）；与 EVs-Model 组比较，各给药组巨噬细胞中以上蛋白表达水平均显著降低（ P ＜ 0.01 ）。

3.8 功能性外泌体对巨噬细胞M1/M2表型极化的影响

如图 7 所示，与 EVs-Con 组比较， EVs-Model 组巨噬细胞 CD86+ 的比例显著升高（ P ＜ 0.01 ）；与 EVs-Model 组比较，各给药组巨噬细胞 CD86+ 细胞比例明显下降（ P ＜ 0.05 ）。

3.9 功能性外泌体对巨噬细胞M1/M2表型基因表达的影响

如图 8-A 所示，与 EVs-Con 组比较， EVs-Model 组巨噬细胞 M1 极化表型相关因子 TNF- α 、 IL-6 和 IL-1 β mRNA 表达水平均明显升高（ P ＜ 0.01 、 0.001 ）， M2 极化表型相关因子 IL-10 和 TGF- β1 mRNA 表达水平明显降低（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）；与 EVs-Model 组比较，各给药组 TNF- α 、 IL-6 和 IL-1 β mRNA 表达水平均明显降低（ P ＜ 0.05 、 0.01 、 0.001 ）， M2 极化表型相关因子 TGF- β1 mRNA 表达水平明显升高（ P ＜ 0.05 、 0.01 、 0001 ）， EVs-HD 组、 EVs-OS 组 M2 极化表型相关因子 IL-10 mRNA 表达水平明显升高（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）， EVs-LD 组 IL-10 mRNA 表达水平明显降低（ P ＜ 0.05 ）。

4 讨论

流感每年都会引发人类呼吸道疾病，对社会经济和人类健康造成了巨大的负担，且 IAV 传播速度快及病毒易于变异，因此对流感的预防和控制越来越困难 [12] 。研究表明， miRNA 在病毒对宿主细胞的影响中发挥着重要作用 [13-14] 。而外泌体作为细胞间物质递送的信使，在 IAV 感染期间，感染细胞释放的外泌体即可以通过携带病毒或宿主 miRNA 参与细胞之间释放和交换信息，调节宿主免疫应答进而增加病毒复制，激活和调节抗病毒反应 [15] 。此外，细胞外泌体可以诱导肺部炎症和促进肺泡巨噬细胞活化，增加巨噬细胞的吞噬功能以消除病原体，选择性激活 M2 巨噬细胞抑制炎症反应，减缓肺部炎症 [16-18] 。

本课题组前期研究表明， IAV 可以诱导肺上皮细胞源外泌体miRNA 的差异表达[7] 。本研究通过对外泌体的鉴定证实，不同干预方式下外泌体的大小无明显变化，但外泌体的分泌会有差异。同时流感病毒诱导的肺上皮源外泌体miR-1249-5p 的表达明显下降，而麻杏石甘汤组外泌体miR-1249-5p 表达水平明显增加。当用不同干预方式获取的肺上皮源外泌体（即功能性外泌体）与巨噬细胞共培养后，各组巨噬细胞miR-1249-5p 表达与外泌体miR-1249-5p 表达相一致，这提示了肺上皮细胞可能通过分泌包裹miR-1249-5p 的外泌体至巨噬细胞内，从而影响巨噬细胞的炎症反应。此外，课题组前期研究发现，IAV 干预后肺上皮细胞源外泌体miR-1249-5p 可以靶向调节SLC4A1 基因抑制NF-κB 信号通路调节炎症[8] ，因此，本研究通过qRT-PCR 和Western blotting 检测了SLC4A1 和NF-κB 信号通路的相关因子，麻杏石甘汤能够明显降低SLC4A1 、NF-κB 、TNF-α 、IL-6 、IL-1β 的表达，提示麻杏石甘汤可以增加外泌体miR-1249-5p 的表达，下调SLC4A1 的表达，进而抑制NF-κB 信号通路。与此同时也发现，功能性外泌体与巨噬细胞共培养后，模型组外泌体干预后的巨噬细胞CD86+ 的比例明显升高，TNF-α 、IL-6 、IL-1β mRNA 的表达增加，IL-10 、TGF-β1 mRNA 的的表达降低，麻杏石甘汤组外泌体能够逆转这一趋势，表明麻杏石甘汤可以借助外泌体抑制巨噬细胞M1 型极化，从而减缓炎症细胞浸润导致的急性肺损伤。

综上，麻杏石甘汤可能通过肺上皮细胞源外泌体递送 miR-1249-5p 到巨噬细胞中，并靶向巨噬细胞中 SLC4A1 调控 NF-κB 信号通路，抑制流感病毒的细胞级联损伤效应的作用机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：马心悦，黄家望，冯芷莹，刘卓琳，王康宇，卢芳国，朱梦晨，李 玲．麻杏石甘汤通过外泌体miR-1249-5p靶向SLC4A1抑制流感病毒细胞级联损伤效应研究 [J]. 中草药, 2023, 54(9):2832-2840.

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