【病毒学技术】转载，浅谈体外诊断试剂中HOOK效应及其解决方法

1、HOOK效应

钩状效应即HOOK效应,是指由于抗原抗体比例不合适而导至假阴性的现象，其中抗体过量叫做前带效应；抗原过量叫做后带效应。简单的说，由于参与反应的抗原抗体比例不合适而导致的假阴性或弱阳性的现象。

Hook效应模式图

2、HOOK效应如何避免

造成HOOK效应的分子基础很复杂，有不同的理论流派，今天我们不谈产生HOOK效应的分子基础，主要聊一下如何避免这种现象。

本文以双抗体夹心法为例，在一定的反应体系里，抗原浓度高到一定程度必然会产生HOOK效应，只是很多项目在实际临床中不太可能遇到那么高浓度的样本罢了。在双抗体夹心反应中，正常情况下形成抗包被抗体---抗原---标记抗体免疫复合物，但是当抗原浓度非常高时，相对而言此时抗体的数量非常少，抗体周围充斥着抗原，无论是包被抗体还是标记抗体都跟抗原饱和式的结合，因此形成包被抗体---抗原---标记抗体免疫复合物的数量就会减少，这就造成了假阴性或者弱阳性的现象。前面也提到了，当抗原浓度足够高的时候，HOOK效应是避免不了的。这里主要结合本人的工作谈谈如何改善这种现象，或者延缓HOOK效应的发生。

原材料，抗体本身的属性决定了很多层面的东西，在本人工作中经常发现某对抗体它就是比另外一对或几对抗体的检测线性范围要宽，当然这些宏观现象跟抗原抗体的结合速率常数，解离速率常数，亲和常数都有关系。所以对于对线性范围要求比较宽的项目比如 HCG、AFP、CEA、MYO、Ferritin等一定要耐心的筛选原材料，另外一个在筛选原材料的时候不要陷入只看跟参比试剂相关性的误区。现在很多研发人员在项目研发时，把相关性看成是评判原材料优劣的唯一标准，甚至有些走火入魔的恨不得把国内国外所有能买得到的原材料统统筛选一遍。在这里我想说的是大可不必，一款优秀的产品，一定是综合性能最优。不同的产品需要侧重的点也一定不一样，超敏肌钙蛋白肯定要侧重低端灵敏度；AFP、CEA、MYO、Ferritin这些项目侧重的肯定是检测线性范围；HCG既要考虑低端灵敏度还要考虑线性范围以及HOOK，很多医院拿HCG来判断是否怀孕以及绝经后妇女体检，未怀孕妇女和绝经后妇女HCG通常含量不高，如果你的HCG试剂低端灵敏度不高，就会出现很多略高于正常区间的值，检测系统信号稍微波动就可能造成浓度的很大波动，让临床医生无法下结论。众所周知怀孕后，孕妇在不同的孕周中HCG的浓度波动非常大，最高能达到几十万mIU/mL，还有一些葡萄胎患者体内HCG浓度能达到几百万mIU/mL。如果试剂很容易出现HOOK，那么临床特别是妇产科是完全没有办法用的。HCG这个项目都做了这么多年了，从胶体金到化学发光，但是大家真觉得很容易做吗，反正我觉得挺难的。对了忘记说了，HCG这个项目还需要考虑特异性这个问题，这个原因我就不说了，大家基本都明白。

感觉上面说的太多了，有点跑题了，对，我们今天主要说HOOK效应。

反应模式，同一个项目，有些厂家用一步法，有些厂家用两步法，理论上两步法能够延缓HOOK效应的发生，但并非所有的两步法都能产生如此效果。研究发现具有多重决定簇的大分子抗原在两步法中同样会产生HOOK效应，小分子抗原则不会，所以抗原“质”的特性是关键因素。建议研发人员在仪器能够实现的前提下尽量多试一些反应模式。大家都明白绝大部分HOOK效应本质上就是抗原浓度过量，试剂研发人员在仪器能够满足取样精度的情况下，加样量要尽可能的少，大家可以去看一下罗氏诊断的AFP、CEA、MYO、HCG、Ferritin这几个项目，除了MYO样本量是15μL外，其他四个项目的样本量均为10μL。我觉得不可能是凑巧吧，要知道罗氏诊断4系列和6系所有项目的样本量为10-50μL，8系样本用量更少，顺便说一句罗氏诊断电化学发光项目的夹心法本质上都是一步法。

有的人会说既然是抗原浓度过高导致的HOOK，可以增加抗体用量，理论上可行，但实际上你真正这么做就会发现效果并不好，而且还会出现背景信号值偏高甚至导致工作曲线变形等不可预知的后果。

还有的人说可以稀释样本，问题是在检测前你并不知道这个样本浓度是高是低，稀释多少倍合适，除非你每个样本都稀释，这样就增大时间和经济成本。

添加“裸”抗体， 顾名思义就是向试剂中添加一些没有标记的抗体（包被抗体或标记抗体甚至两者同时）中和过多的抗原，这种方法确实可以在一定程度上提高线性范围上限，但是也会牺牲掉一些低端的灵敏度。

罗氏诊断专利讲了一个方法，大概过程就是将抗体先用pepsin酶切成F(ab)2片段，然后将这些片段用DSS等交联剂交联成多聚体，利用分子筛选出所需分子量的多聚体，再进行标记，我个人理解就是同样抗体浓度下，大大增加了可以和抗原结合的位点，同时由于切除掉了Fc段，还能减小非特异性结合。

好了，关于HOOK效应就说这么多了，有什么错误的地方还请广大同行专家指正。

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