王克剑 | 水稻中实现自繁克隆种子，结实率媲美野生型

杂交像开盲盒，打开基因组合的万千种可能。

将两个不同纯系进行杂交，得到的杂交后代在某些性状（如产量、生长速度、抗逆性）上优于两个亲本，这就是杂种优势。半个多世纪以来，育种家培育出了大量适合人类不同需求的杂交品种，为粮食生产、安全和稳定做出了重大贡献。

然而，当杂交后代继续繁衍下去时，有性生殖过程中的基因重组导致性状分离，上一代基因的“最佳搭档”无法“独善其身”，优良性状又遭丢失。为此，每年都需要培育新的杂交种子，费时费力又昂贵。

如果植物可以自动固定基因型、自发结出克隆种子呢？

这并非天方夜谭，自然界中确有一种被称为无融合生殖（Apomixis）的无性繁殖方式，使植物在不受精的情况下，产生与母体基因型相同的克隆种子。可惜这种诱人的现象并不存在于主要作物中，因此，培育无融合生殖作物长期被誉为农业研究领域的“圣杯”，曾一度引起科学家欲将其在主要作物中实现的研究热潮，但重重的困难又使之在几十年后退为冷门。

2019 年，中国水稻研究所王克剑团队首次建立了杂交水稻无融合生殖体系，获得了杂交水稻的克隆种子，证实杂交水稻自繁种的可行性。今年 1 月，王克剑团队在杂交稻的无融合生殖研究中再次取得新进展：得到了结实率几乎不受影响的无融合生殖杂交水稻植株——解决了无融合生殖体系中存在的植株结实率低的问题；相关研究成果发表在 Molecular Plant 上，题为“Synthetic apomixis with normal hybrid rice seed production”。生辉 Agri Tech 借此机会对王克剑进行了专访，聊了聊如何人工实现杂交水稻的自繁种。

王克剑现为中国水稻研究所副所长、水稻生物学国家重点实验室常务副主任，国家水稻产业技术体系岗位科学家，农业农村部“农业科研杰出人才”，中国农科院科技创新工程团队首席科学家，中国农科院农科英才领军A类人才；曾获 2020 年度陈嘉庚青年科学奖（农业领域首次）。

▲图 | 王克剑（受访者提供）

开有性之花，结无性之果

Apomixis 由意为 “away from” + “mixing” 的希腊语构成，指“没有雌雄配子融合”，即不经过受精的无性繁殖。但字面意思并未精确指出它的特点，只因命名较早，惯用至今。

首先，无融合生殖与嫁接、扦插、压条的营养体繁殖不同。它兼具有性、无性的生殖特性——虽无受精、无父母基因的重组，却像有性生殖那样开花结果，因此种子携带着与母本同样的基因，也就是母本的克隆。

王克剑将之概括为“开有性之花，结无性之果”。

现已在四百多种植物中发现了无融合生殖，如苹果、柑橘、蒲公英、狼尾草等。与小麦、水稻不同，苹果、柑橘的育种需求则是打破无融合生殖、利用有性生殖导入基因多样性；“况且苹果是林木，可通过嫁接培育，无融合生殖的优势未能明显发挥出来。”而这个优势正为农作物所需，“遗传育种时希望有性生殖，繁种时希望无融合生殖。”王克剑希望将无融合生殖系统引入粮食作物中，以给农业发展做出更大贡献。

迄今为止，科学家采用过两种方法将无融合生殖特性引入重要农作物中，包括从天然无融合生殖体中渗入无融合生殖基因，以及通过分子工程建立人工合成的无融合生殖体系。“前者获得的成功有限，而后者通过组装无融合生殖的不同元素，在植物中创建无性生殖繁殖模式，有可能在未来彻底改变农业。”引自王克剑最近发表在 Current Opinion in Biotechnology 上的综述“Synthetic apomixis: the beginning of a new era”。

水稻中建立高结实率的无融合生殖体系

此前，科学家已经发现了控制减数分裂过程的三个关键基因 OSD1、PAIR1和 REC8。虽然单个基因的突变会导致结实率丧失或降低，但三个基因的同时突变会形成新平衡。于是，在植物中构建无融合生殖体系的思路显而易见：通过基因编辑的手段，将以上三个基因同时突变，减数分裂过程会转换为类似有丝分裂过程——这是实现克隆配子的第一步。

因此，“有丝分裂代替减数分裂”（Mitosis instead of Meiosis，MiMe） 的策略已被用于产生未减半和未重组的克隆配子。

第二步借鉴了孤雌生殖的机制。有性生殖中，受精后，受精卵的发育才被启动；而孤雌生殖在于一些能够单独激活卵细胞发育的关键基因，可以让卵细胞在不受精时提前进行自主发育。

BABY BOOM（BBM）就是在无融合生殖的狼尾草中发现的一种能够诱导孤雌生殖的基因。BBM 属于 AP2 转录因子家族，在胚胎发育中扮演重要角色。当水稻内源性 BBM1 在卵细胞中异位表达时，也可以诱导水稻的孤雌生殖。

前期王克剑团队和美国 Venkatesan Sundaresan 团队分别通过在水稻中将 MiMe 与 MATRILINEAL 基因的突变或 BBM1 的异位表达相结合，建立了无融合生殖体系。然而，与野生型相比，以上两种策略的结实率均显著降低，无法在农业中应用。

王克剑团队希望探索 BBM 家族的其他成员诱导孤雌生殖的作用。在其最新研究成果中，他们利用能够诱导卵细胞特异性表达的拟南芥启动子 pDD45，在杂交稻春优 84（CY84）中，通过农杆菌介导的遗传转化，分别转入了水稻中其他三个类似于 BBM1 但表达模式各不相同的 BBM2、BBM3、BBM4 基因。

为了确定遗传转化植物是否成功诱导了孤雌生殖，团队通过分子标记，发现仅在转入 BBM4 的 411 个后代中有 13 个为纯合子个体；通过全基因组测序，发现纯合子个体确实由单个配子发育而来；流式细胞术进一步验证了纯合子植物都是单倍体。而所有单倍体植物都表现出株高降低、穗长减小、完全丧失生殖能力。这些结果表明，BBM4 的卵细胞异位表达能够触发杂交水稻的孤雌生殖并诱导单倍体。

接下来，为了探索 BBM4 异位表达是否可以应用于人工合成无融合生殖，王克剑团队将其与 MiMe 结合，如此构建的植物记作 Fix2。

营养阶段的 Fix2 表现出与春优84相似的正常形态。出乎意料的是，成熟期的 Fix2 结实率（80.9–86.1%）竟然堪比春优 84（82.1–86.6%）。

那么，高产的 Fix2，其中有多少种子是克隆的，而不是有性生殖而来的呢？团队继而分析了三株 Fix2 的下一代，发现在 156、152、169 株的 Fix2 后代中，只有 2、2、3 株是二倍体，即克隆种子，而其他都是四倍体的非克隆种子。

团队将这些二倍体种子种下以研究表型。植株、穗、籽粒形态皆与春优 84 相似；结实率 80.9–82%，也与春优 84 相当；全基因组测序表明，春优 84 的杂合基因型也在这些二倍体克隆植物中得到了完全固定。

“通过这项研究，我们找到了一个新的关键基因，实现了克隆种子结实率的大幅度提升，接近野生型或正常杂交水稻的 80-85%。”王克剑说。

还需说明的是，无融合生殖的水稻也需受精才能完整地长出种子。这是由于被子植物发生双受精：一个雄配子体形成两个精子，一个与卵细胞融合发育成胚，另一个与极核融合发育成胚乳。胚乳储存营养，为种子发育所必须，但并不会影响遗传信息。

克隆效率待提升

王克剑的试验中，结实率趋近正常，但克隆效率还较低。而近日，由加州大学戴维斯分校植物生物学和植物科学系的 Venkatesan Sundaresan 教授和助理教授 Imtiyaz Khanday 领导团队发表在 Nature Communications 的论文“High-frequency synthetic apomixis in hybrid rice”，报道了使用商业杂交水稻品系实现了 95% 的克隆效率，并表明该过程可以持续至少三代。但其结实率却较低，为 27.0~35.5%。

结实率和克隆效率相矛盾的原因尚不明确。“可能与基因诱导效率有关，比如卵细胞中基因的启动速度。”王克剑表示，针对这一局限，“下一步将寻找更强的启动子以及更优的孤雌生殖基因，让转入的基因更早、更高峰度地在卵细胞中表达。”

潜在基因会继续从水稻中寻找，也会参考前人研究，在柑橘、花椒等其他物种中寻找。

不过，由于国内转基因政策的限制，基于转基因的无融合生殖水稻短期内恐难以推广。王克剑表示，“将来希望优化技术，建立不含有转基因成分的无融合生殖体系。”

在国内，该领域的学者还有华中农大园艺林学学院教授徐强与西北农林科技大学林学院教授魏安智，他们分别致力于柑橘和花椒的无融合生殖的机理解析与育种应用。相比于果树林木，在玉米、高粱中研究无融合生殖更困难，因而也进步缓慢。

在国际上，美国盖茨基金会（Bill & Melinda Gates Foundation）以及很多跨国种业公司也在支持无融合生殖的攻关。

在主要作物中实现无融合生殖，可谓道阻且长。不过，王克剑认为“迄今为止，这些点点滴滴的积累至少证明了方向可行。而且目前来看结果比较好。”他相信这个方向在国内外众多科学家的努力下最终一定能走向生产。