Nature | 一种全新的可在不相关物种中实现终止密码子重置的分子机制

撰文 | 望夜

标准密码子表包含64个三联体密码子，其中61个可编码氨基酸，是有义密码子，另外3个为终止密码子。但在某些线粒体和细菌基因组中存在密码子重置 （reassignment） 现象，迄今已报道至少30种【1】。概况来说，改变可分为三类：无义变有义、有义变有义、有义变无义，其中尤以第一类最常见【2】，如某些微生物基因组使用UAA和UAG编码谷氨酰胺。若想实现密码子的重置，需要在tRNA的反密码子环引入突变、或对tRNA上的摇摆碱基进行修饰、或改造氨酰tRNA合成酶对相应tRNA的识别、或放宽真核释放因子 （eRF） 识别密码子的保真度。

为何会出现密码子的重置呢？科学家曾提出多个假设：密码子捕获模型【3】推测源于特定密码子分布的遗传漂变，在进化中某些密码子可能在胁迫作用下逐渐消失，而当其因种种原因再次出现时，可能会被近似匹配的另一种密码子的tRNA“捕获”。“不明确中间体”理论则认为tRNA的自发突变改变其识别的特异性，转而识别非匹配的密码子。中间体步骤随后在翻译压力下导致密码子的替换【4】。“tRNA缺失驱动重置”理论也认为存在一个中间体阶段，某个密码子由于相应tRNA基因的缺失或突变，产生压力促使同义替换允许另一种tRNA接替识别任务【5】。

动质体 （Kinetoplastid） 原生动物，如锥虫、利什曼原虫、植物单胞菌，是重要病原体【6】，通常认为其基因组使用标准密码子。但也有例外，如近期发现一种锥虫Blastocrithidia sp.可能将全部三种终止密码子重置为有义密码子【7】。此外，甲藻Amoebophrya【8】、纤毛虫Parduczia和Condylostoma【9】中也发现密码子重置的现象，但重置背后的分子机制目前尚不明确。

近日，捷克科学院的Zdeněk Paris、Julius Lukeš与Leoš Shivaya Valášek联合领导的研究组对一种新发现的锥虫中UGA重置为色氨酸的分子机制进行研究，发现真核生物中一种通用的终止密码子重置特征，即联合tRNATrp反密码子臂的缩短及eRF1中的特定位点改变。相关研究结果以Short tRNA anticodon stem and mutant eRF1 allow stop codon reassignment为题发表在Nature杂志。

作者在一种蝽 （Eysarcoris aeneus） 的肠后段分离出一种全新的锥虫，命名为B. nonstop Votýpka et Lukeš, sp. nov.，形态学观察和18S rRNA测序确认其为新种。作者对其进行基因组、转录组和蛋白质组测序，发现其基因组的G+C含量仅有35%，而其它锥虫的平均G+C含量为51%。比较显示Blastocrithidia属的祖先很可能经历过严重的A+T突变压力，导致一系列密码子重置 （UGG-to-UGA、GAG-to-UAG、GAA-to-UAA、UGA-to-UAA、UAG-to-UAA） 。质谱分析确认终止密码子重置的发生，UGA实际上编码色氨酸，UAG和UAA （UAR） 编码谷氨酸。介于真核生物普遍存在无义密码介导的降解途径，可清除带有提前终止密码子的mRNA【10】，作者推测锥虫科进化早期丢失该通路中两种关键组分UPF1和UPF2，可能成为允许终止子重置的关键前提。

利用重新开发的注释算法，作者发现在蛋白编码基因内部出现的重置终止子与相关蛋白的含量呈负相关：即当蛋白表达水平低时，其编码框中含有的大量UGA和UAR；而蛋白表达水平高时，这类密码子很少或不出现。在推测的7259种蛋白编码基因中，仅228种编码框内不含UGA和UAR，基因分析表明它们编码核糖体蛋白、胞浆翻译因子、组蛋白、线粒体电子传递链组分等高表达水平的蛋白。

这种新锥虫真正的终止密码子是哪种呢？作者通过BLASTp检索和3’末端比对发现，大部分基因以UAA作为终止子，同时排除UAG和UGA作为终止子的可能，即B. nonstop仅使用UAA作为唯一终止密码子。

接着，作者分析UAR重置的机制。B. nonstop基因组共编码70种tRNA基因，其中包含识别UAR的tRNAGluCUA和tRNAGluUUA，序列聚类分析支持它们是由标准tRNA进化而来。Northern blot确认两种tRNA可以完成氨酰化过程。但作者在基因组中没有找到将UGA解码为色氨酸的tRNA，作者起初怀疑典型的tRNATrpCCA可能会在胞浆中发生CCA-to-UCA的反密码子编辑，但未检出此种转录后编辑事件。

于是作者转而分析tRNA二级结构，发现tRNATrpCCA的反密码子臂仅有4-bp，而非其它锥虫中常见的5-bp结构，这种tRNA反密码子臂变短的情况在同样存在终止子重置的纤毛虫C. magnum中也发现过。通读实验确认4-bp反密码子臂的tRNATrpCCA可以解码UGA，而人为将其变为5-bp反密码子臂时，通读效率显著降低。此外，作者还通过质谱排除tRNATrpCCA上其他修饰导致解码能力改变的可能。进一步地，作者成功将这种缩短反密码子臂的策略应用在酿酒酵母 （S. cerevisiae） 及纤毛虫C. magnum中实现UGA重置。

文献报道锥虫的eRF1带有一个保守的Ser74Gly突变【11】，与UGA的解码通读相关。该氨基酸的变化是否与B. nonstop短臂之间存在关联性呢？作者在酿酒酵母通读模型中验证确认该突变可以实现UGA的通读，且4-bp臂长比5-bp臂长有更高的通读优势，因此B. nonstop eRF1中天然存在的Ser74Gly突变与更短的tRNATrp反密码子臂协力共同促进UGA重置编码色氨酸。

总结全文，作者报道了一种全新的可在不相关物种中实现终止密码子重置的分子机制。作者发现一种新发现的锥虫基因组中存在终止密码子重置现象，其UAG和UGA出现在基因读码框内部，编码谷氨酸和色氨酸，而仅有UAA作为真正的终止密码子。其基因组编码两种tRNAGlu反密码子可完全识别UAG和UAA，实现对两种终止子的重置。对UGA编码色氨酸的重置采取的是一种不同的路径，其tRNATrpCCA的反密码子臂由5对碱基缩减为4对，同时配合eRF1中特异位点突变，实现对UGA的通读。这种策略也可应用于其他物种中密码子的重置改造。

值得注意的是，Nature杂志同时还在News and views模块发文介绍本文的研究结果。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-022-05584-2

https://www.nature.com/articles/d41586-022-04585-5

参考文献

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9. Heaphy, S. M., et al. Novel ciliate genetic code variants including the reassignment of all three stop codons to sense codons in Condylostoma magnum.Mol. Biol. Evol.33, 2885–2889 (2016).

10. Baranov, P. V., et al. Augmented genetic decoding: global, local and temporal alterations of decoding processes and codon meaning.Nat. Rev. Genet.16, 517–529 (2015).

11. Záhonová, K., et al. An unprecedented non-canonical nuclear genetic code with all three termination codons reassigned as sense codons.Curr. Biol.26, 2364–2369 (2016).