Nature Biotechnol | 新型RNA敲低工具CRISPR-Csm, 高效率、低脱靶

撰文 | 言笑

2012年CRISPR的出现彻底革新了基因编辑领域。与其他基因编辑方法相比，CRISPR使用起来廉价、迅速且简单，也因此席卷全球实验室，成为研究人员的“宠儿”。利用CRISPR技术，研究人员可以修正人类缺陷基因以治疗遗传疾病，可以改变病原体基因以消灭传染病，可以改良作物基因以培育生命力更加顽强的优势品种等等。由于CRISPR在多领域中展现出的巨大应用价值，2020年的诺贝尔化学奖授予了这一技术的开创者加州大学伯克利分校的 Jennifer Doudna 和马克斯普朗克研究所的Emmanuelle Charpentier。2023年1月20日，Jennifer在Science杂志上发表了一篇题为CRISPR technology: A decade of genome editing is only the beginning的综述【1】，总结了十年来CRISPR基因编辑技术的成功、机遇、挑战和社会影响 （BioArt报道：Science | Jennifer Doudna综述CRISPR这十年：十年磨“亿”剪，把把出新“锋”） 。

CRISPR技术能够高效且精准地靶向编辑DNA，但这种方式带来的DNA双链断裂也可能会导致一系列潜在风险，进而限制其在临床上的应用。对细胞和生物体中的RNA和蛋白质水平进行修改或调控，能够避免对DNA造成永久性改变，这对基础研究和疾病治疗都具有无法估量的价值。然而，由于现有技术的效率和精确度欠佳，对哺乳动物细胞的基因转录本进行稳定、精确的靶向敲低 （knock-down, KD） 在现阶段仍是一个巨大的挑战。

2023年1月23日，Jennifer Doudna团队在Nature biotechnology杂志上在线发表了题为Precise transcript targeting by CRISPR-Csm complexes的文章 （该论文于2022年6月在预印本平台bioRxiv上线） ，揭示了CRISPR技术在RNA敲低领域的最新应用。作者发现了一种CRISPR-Csm复合物，可同时靶向细胞核和细胞质转录本进而敲低RNA，在人类细胞中实现了最小化脱靶效应和高效RNA靶向敲低，敲低效率可达90%-99%。该研究证实了多亚基CRISPR-Cas系统作为真核生物RNA靶向工具的可行性和有效性。

在过去的20年中，研究人员已经成功利用RNA干扰技术 （RNAi） 实现了真核生物中的靶向RNA敲低，这种技术利用小干扰RNA （siRNA） 引导内源性核酸酶切割携带互补序列的靶向 RNA【2】。然而，RNAi 技术存在着一些固有的局限性：（1）RNAi可能会意外切割具有部分互补序列的靶标【3-4】；（2）siRNA在靶向细胞核RNA方面效率不高，因为RNAi机制主要存在于细胞质中【5】；（3）RNAi与一些真核模式系统不相容 （如缺乏RNAi机制的出芽酵母和患有非特异性发育缺陷的斑马鱼胚胎）【6-7】。CRISPR-Cas技术可以作为RNA敲低的另一个选择。与RNAi类似，Cas核酸酶使用小RNA或CRISPR RNA （crRNA） 通过碱基配对互补来识别核酸靶标。其中Cas13能够对真核生物的RNA进行切割，已被开发用于RNA病毒检测工具 （例如SHERLOCK系统）【8-10】。但Cas13不仅顺式切割互补RNA，同时也会反式降解附近的非互补RNA （反式切割）（图1a），进而导致细胞毒性和/或细胞死亡【11-12】。因此，Cas13也不太适合用作特异性RNA编辑工具。

图1

2022年8月，杨辉团队开发了一种高保真Cas13突变体hfCas13d，提高了其对靶标RNA的降解能力，又显著降低了随机切割活性，为CRISPR-Cas13系统的安全应用提供了新思路（）。而Jennifer团队则把目光放到了其他CRISPR系统上—CRISPR-Csm。虽然多亚基Cas效应子在自然界中广泛存在，但与单亚基Cas相比，多亚基Cas成分复杂，因此在真核生物中极少被应用。CRISPR-Csm是一类III型CRISPR系统，Csm复合物由5个不同亚基组成 （Csm1-5） ，并依赖于Cas6来处理前体crRNA（图1b-c）。基于以下原因，作者从嗜热链球菌中选择了III-A Csm复合物：（1）它在生化、结构和细菌中已经得到了广泛的表征；（2）它在37°C下发挥最佳功能；（3）它已被证明在核糖核蛋白 （ribonucleoprotein, RNP） 递送后的斑马鱼胚胎和人类细胞中起作用；（4）它的成分比类似的III-B Cmr型复合物少。

首先，作者对Csm复合物进行了密码子优化并添加细胞核定位信号。通过单载体递送CRISPR-Csm系统，对人类细胞中的11个RNA进行编辑 （3个细胞核非编码RNA和8个细胞质mRNA） ，每个靶点测试三个 crRNA。结果显示，与非靶向的 crRNA 对照组相比，Csm实现了对全部11个RNA靶点的高效敲低 （90%-99%） ，表明 Csm 是一个高度稳定且高效的RNA敲低工具，可以对细胞质RNA和细胞核RNA都实现精确敲低。

随后，研究人员进行了 RNA 测序，以检查Csm介导的敲低在细胞中的潜在脱靶效应，并将Csm、Cas13和RNAi三者进行了比较。与未处理样本相比，Csm 组在目标转录本上实现了显著敲低，同时几乎未产生其他差异表达的基因。相比之下，Cas13能够有效敲低靶标RNA，但同时也会影响数百个非靶标RNA水平。而RNAi组对靶标RNA的敲低效果取决于该RNA定位于细胞核还是细胞质，同时也会影响少量非靶标RNA水平。此外，细胞毒性检测显示，Cas13 处理的细胞，其增殖能力显著下降，而 Csm 或 shRNA 处理的细胞，增殖能力几乎不受影响。这些数据表明，Csm是三种RNA敲低方式中的最优选择。

综上所述，Csm是一种极具吸引力的RNA敲低工具：（1）作为仅在原核生物中发现的独立系统，Csm可以引入真核生物中，而不会与宿主RNA调节途径相交；（2）与RNAi相比，Csm可以定位到细胞核，可靶向核非编码RNA和pre-mRNAs；（3）与Cas13相比，Csm仅在crRNA：靶互补区内进行顺式切割，因而不具有反式切割活性，更精准、更安全。此外，失活的Csm可与RNA特异性、持久地结合，可应用于活细胞RNA成像。

https://doi.org/10.1038/s41587-022-01649-9

制版人：十一

参考文献

1. Joy Y. W., Jennifer A. D.. CRISPR technology: A decade of genome editing is only the beginning. Science 379, 6629 (2023).

2. Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136, 642-655 (2009).

3. Jackson, A. L. et al. Expression profiling reveals of-target gene regulation by RNAi. Nat. Biotechnol. 21, 635-637 (2003).

4. Birmingham, A. et al. 3′ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi of-targets. Nat. Methods 3, 199-204 (2006).

5. Zeng, Y. & Cullen, B. R. RNA interference in human cells is restricted to the cytoplasm. RNA 8, 855-860 (2002).

6. Aravind, L., Watanabe, H., Lipman, D. J., Koonin, E. V. Lineage-specific loss and divergence of functionally linked genes in eukaryotes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 11319-11324 (2000).

7. Zhao, Z., Cao, Y., Li, M. & Meng, A. Double-stranded RNA injection produces nonspecific defects in zebrafish. Dev. Biol. 229, 215-223 (2001).

8. Abudayyeh, O. O. et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature 550, 280–284 (2017).

9. Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR efector. Science 353, aaf5573 (2016).

10. Konermann, S. et al. Transcriptome engineering with RNA-targeting type VI-D CRISPR efectors. Cell 173, 665–676 (2018).

11. Song, J.-J., Smith, S. K., Hannon, G. J. & Joshua-Tor, L. Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305, 1434–1437 (2004).

12. East-Seletsky, A. et al. Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection. Nature 538, 270–273 (2016).

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