《食品科学》：大连大学窦少华副教授等：人工设计短肽PF1和PF2的克隆表达及其对葡萄糖氧化酶活性的影响

葡萄糖氧化酶（GOD）是一种氧化还原酶，以分子氧为电子受体，与过氧化氢酶形成氧化还原系统，专一性催化β-D-葡萄糖转化为葡萄糖酸。GOD的催化效率和反应速率通常受各种因素影响，如酸度和碱度、温度、氧气和动力学参数。GOD作为一种高特异性氧化还原酶，在食品领域发挥着极其重要的作用。

大连大学生命健康学院，辽宁省海洋微生物工程技术研究中心的李传博、鲁明杰、窦少华*等将PF1、PF2两条短肽的基因在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中克隆表达，产物经Ni-NTA纯化后加入GOD酶促反应，并对GOD活力及Zeta电位进行检测，旨在为今后研究肽链PF1、PF2对GOD之间相互作用提供物质基础，可以为酶的食品、医药、农业应用等研究提供新的科学依据。

1、人工设计肽链PF1、PF2基因的PCR扩增

利用特异性引物PF1-F、PF1-R和PF2-F、PF2-R，使用PF1、PF2基因DNA作为模板扩增目的片段，大小约为309 bp（图1），与预计的片段大小相近。切胶回收并测序，确定为目的基因的DNA片段。

2、重组质粒pET-30a（+）-PF1、pET-30a（+）-PF2的构建及鉴定

PF1、PF2基因PCR产物双酶切

用Nde I/Hind III双酶切PF1、PF2基因PCR产物，取1 μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，图2结果显示，在750 bp附近出现特异性条带与理论设计值相符。

原核表达质粒pET-30a（+）双酶切

用Nde I/Hind III双酶切原核表达载体pET-30a（+），取1 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。质粒pET-30a（+）双酶切产物条带单一，且在5 000～6 000 bp之间，符合预期。

菌落PCR筛选阳性克隆

从pET-30a（+）-PF1/BL21、pET-30a（+）-PF2/BL21转化的平板上分别随机挑取17个白斑直接作为模板进行PCR扩增（图4），pET-30a（+）-PF1/BL21经电泳分析发现8号、9号和12号PCR产物与目的基因（309 bp）大小一致，表明8号、9号和12号成功将靶基因与表达质粒pET-30a（+）相连。pET-30a（+）-PF2/BL21经电泳分析发现4号、9号和15号PCR产物与目的基因（309 bp）大小一致，表明4号、9号和15号成功将靶基因成功连接到表达质粒pET-30a（+）上。

重组质粒的酶切鉴定和测序鉴定

结果如图5所示。可以看出，重组质粒pET-30a（+）-PF1、pET-30a（+）-PF2酶切产物片段大小分别约为309 bp和5 422 bp，即表达的pET-30a（+）-PF1、pET-30a（+）-PF2和原核表达载体pET-30a（+）。说明PF1、PF2基因已成功亚克隆至表达载体pET-30a（+）中。

3、pET-30a（+）-PF1、pET-30a（+）-PF2重组质粒在E. coli BL21（DE3）中的表达

如图6所示，泳道4、5、7、8、10、11约11 kDa蛋白带与PF1的理论分子质量（11.1 kDa）一致，表明IPTG成功诱导蛋白表达。肽链PF1在15 ℃、0.1 mmol/L IPTG诱导16 h表达较好。与泳道3、6、9未诱导的阴性对照相比，重组菌pET-30a（+）-PF1/BL21在约11 kDa处表现出特异性蛋白带，重组蛋白成功表达，且可溶性较好。

由图7可以看出，诱导产物在相同位置具有单个特异性条带。PF1蛋白分子大小与SDS-PAGE鉴定大小一致。

如图8所示，泳道4、5、7、8约11 kDa蛋白带与PF2的理论分子质量（11.1 kDa）一致，表明IPTG成功诱导表达蛋白表达。肽链PF2在37 ℃、0.1 mmol/L IPTG诱导4 h表达较好。与泳道3、6、9未诱导的阴性对照相比重组菌pET-30a（+）-PF2/BL21在约11 kDa处表现出特异性蛋白带，重组蛋白成功表达，且可溶性较好。

由图9可以看出，诱导产物在相同位置具有单个特异性条带。PF2蛋白分子大小与SDS-PAGE鉴定大小一致。

4、pET-30a（+）-PF1、pET-30a（+）-PF2重组质粒Ni-NTA纯化

通过Ni-NTA亲和层析柱纯化PF1、PF2，SDS-PAGE检测洗脱的收集液，如图10所示。目标蛋白主要被300 mmol/L咪唑溶液洗脱下来，且洗脱液中无杂蛋白。

5、纯化后蛋白PF1和PF2对GOD Zeta电位检测

由表2可知，纯化后蛋白PF1表面Zeta电位为-18.16 mV，带负电荷，而PF2表面Zeta电位为10.32 mV，带正电荷。且经过PF1处理过的GOD电位由-14.60 mV下降至-16.07 mV，PF2处理过得GOD电位由-14.60 mV上升至-9.26 mV。

6、纯化后蛋白PF1和PF2对GOD活力影响

由表3可知，使用纯化后带负电荷蛋白PF1处理后GOD活力提高了8.34%，带正电荷蛋白PF2处理后GOD活力降低了6.88%。证明本研究生物方法合成的带不同电荷蛋白对GOD活力同样有激活和抑制作用。

结论

人工设计并合成了2 条肽链PF1、PF2，基因全长309 bp，以ATG作为起始密码子开始，以TGA作为终止密码子结束，编码93个氨基酸肽链。将其扩增至pET-30a（+）载体中，构建了重组质粒pET-30a（+）-PF1和pET-30a（+）-PF2。随后将酶切鉴定正确的表达质粒pET-30a（+）-PF1和pET-30a（+）-PF2转化至宿主细胞E. coli BL21（DE3）中，0.1 mmol/L IPTG大量诱导表达收集菌体细胞。通过超声破碎菌体细胞以获得粗酶溶液，利用重组质粒pET-30a（+）-PF1和pET-30a（+）-PF2上C端融合6个组氨酸的蛋白质标签，经Ni-NTA纯化分离纯化得到纯蛋白。SDS-PAGE与Western Blot分析表明：表达出的靶蛋白分子质量为11.1 kDa，这与预估大小一致。PF1和PF2人工设计蛋白的pI值分别为12.01、3.18，且表达产物以可溶性蛋白存在于细胞浆中。以上结果都指向同一结论：人工设计肽链基因PF1、PF2在E. coli BL21（DE3）中得到成功表达。

纯化后的蛋白PF1和PF2在pH 5.5的缓冲液中测定Zeta电位后发现，PF1 Zeta电位为-18.16 mV，带负电；PF2 Zeta电位为10.32 mV，带正电。通过使用纯化后的蛋白PF1和PF2处理GOD后，GOD活力出现了明显的变化，今后可以设计并合成更多的肽链对GOD进行处理，检测其对GOD活力的影响，并检测肽链与GOD的相互作用。短肽PF1和PF2的基因克隆及表达为后续将短肽PF1和PF2应用于大规模食品或工业化生产新型酶激活剂打下坚实基础。

一

通信作者简介

窦少华，男，博士，大连大学生命健康学院副教授，硕士生导师，九三学社社员，辽宁省“百千万人才工程”千人层次，大连市高端人才。兼任辽宁省海洋微生物工程技术研究中心常务副主任，中国食品科学技术学会食品装备与智能制造分会理事，辽宁省微生物学会理事。主要从事微生物工程及酶工程应用基础研究。先后主持及参与辽宁省自然科学基金及863、973、国家自然科学基金、省市级课题10余项，获辽宁省技术发明二等奖2项，辽宁省教学成果一等奖1项，授权中国发明专利3项，发表论文30余篇，副主编教材2部，专著2部，培养及指导研究生10余人。

二

第一作者简介

李传博，男，大连大学生命健康学院生物学专业研究生，中共党员。本科就读于大庆师范学院生物制药专业，现主要研究方向为微生物与酶工程。先后于国际、国内学术期刊发表多篇文章。

本文《人工设计短肽PF1和PF2的克隆表达及其对葡萄糖氧化酶活性的影响》来源于《食品科学》2022年43卷22期215-220页，作者：李传博，鲁明杰，张庆芳，林禹彤，窦少华。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211223-271。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

图片来源于文章原文及摄图网。

Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。

投稿网址：

https://www.sciopen.com/journal/2958-4124