浙大团队提高酵母合成甾醇产量，植物第六大激素有望实现工业合成

油菜素甾醇（Brassinosteroids，BRs），被公认为继生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯之后的第六大类植物激素，参与调节许多重要的植物生理活动，如细胞伸长、细胞分裂、种子萌发、免疫和繁殖等。

植物激素是在植物内产生的信号分子，浓度极低。植物激素控制着植物生长发育的各个方面，从胚胎发生、调节器官大小、病原体防御、胁迫耐受性到生殖发育。

BRs 最早由 Michelle 等人于 1970 年发现，即从油菜（Brassica napus）花粉中提取的一种能促进植物茎杆伸长和细胞分裂的高活性物质。第一种被分离出来并确定化学结构的 BR 则是芸苔素内酯（Brassinolide，BL），由 Grove 等人于 1979 年在油菜花粉中发现，是天然BRs中最具生物活性的化合物，在农业和工业应用中具有巨大潜力。迄今为止，已有 70 余种 BRs 被发现。

▲图 | 芸苔素内酯（BL）

然而，这种促进生长的植物激素的天然丰度极低——Grove 等人从 40 千克蜜蜂收集的油菜花粉中仅仅分离出 4 毫克 BL。BRs 结构复杂，科学家已经提出并尝试了基于天然有效甾醇的半合成。目前，只有两种活性相对较低的 BRs 24-epi-brassinolide（EBL）和 28-homo-brassinolide（HBL）可以从麦角甾醇（ergosterol）和豆甾醇（stigmasterol）合成且已实现商业化。

BL 难以依靠植物提取获得，而化学合成又受限于合成前体的缺失，作为 BRs 中最活跃的一员，BL 尚未在农业和工业中得到广泛应用。因此十分有必要发展一种可扩展的生产策略。

近日，由浙江大学化学工程与生物工程学院杨立荣、连佳长、林建平、吴绵斌等人发表于Nature Communications上的最新研究成果“Manipulation of sterol homeostasis for the production of 24-epi-ergosterol in industrial yeast”利用合成生物学构建了一个酵母细胞工厂，用于可扩展生产 BL 半合成的前体，也是一种非天然的甾醇——24-epi-ergosterol。

首先，为实现酵母中 24-epi-ergosterol 的从头生物合成，研究人员构建了一条人工通路：引入了来自植物的甾醇还原酶，然后进行酶定向进化。随后，操纵甾醇稳态保持甾醇酰基化和甾醇酯水解之间的平衡，以生产 24-epi-ergosterol。使用补料分批发酵，24-epi-ergosterol 滴度（产量）达到 2.76 g/L。

对于该反应，实现高水平生产的重点是控制甾醇稳态。该研究的甾醇稳态工程策略可适用于其他具有重要经济意义的植物甾醇的批量生产。

从头合成，为什么是 24-epi-ergosterol？

在先前的研究中，从海洋稀有无脊椎动物 Crinoid 分离出的一种甾醇 crinosterol 被提议作为 BL 的合成前体。不幸的是，crinosterol 的可用性并不理想。

▲图 | 上、左下、右下分别为：由麦角甾醇合成 EBL、由豆甾醇合成 HBL、由 crinosterol/本实验所探究的 24-epi-ergosterol 合成 BL。

无论 BL 或 crinosterol，生物合成路径都不明确。在此情况下，研究人员寄希望于寻找某种与 crinosterol 结构相似的甾醇分子。于是，他们比较了麦角甾醇、豆甾醇和 crinosterol，提出 24-epi-ergosterol（麦角甾醇的非对映异构体）或可作为 BL 半合成的替代方案。

不过，24-epi-ergosterol 亦“来历不明”，自然界中尚未发现其生物合成路径。换言之，作为一种非天然甾醇，尚未发现合成它的酶。但通过遗传数据库的扩展和通过定向进化改善酶特性，或许能够设计人工合成途径和微生物细胞工厂。

因此，研究人员探索了植物中甾醇生物合成的遗传数据库，得知在酵母中 ergosta-5,7,22,24(28)-tetraene-3β-ol 被 ERG4（指酵母中的Δ24(28)-甾醇还原酶）转化为麦角甾醇；在植物中，DWF1（指植物中的Δ24(28)-甾醇还原酶）催化 24-methylenecholesterol 合成菜油甾醇。基于手性和结构相似性，预计在酵母中引入 DWF1，能够产生目标产物 24-epi-ergosterol。

▲图 | 在酵母中引入来自植物的 DWF1 以合成 24-epi-ergosterol

验证实验表明，引入 DWF1 的确能够使酵母产生 24-epi-ergosterol。但 DWF1 对底物 ergosta-5,7,22,24(28)-tetraen-3β-ol 的活性远远低于 ERG4，生产水平仍远未达到工业化应用要求，表明需要通过蛋白质工程和代谢工程进行进一步修饰。

由于缺乏 DWF1 和同源酶的晶体结构，研究人员只能将对 DWF1 的改造诉诸于定向进化，为此需要高通量筛选（HTS）方法。基于 erg4Δ 酵母对十二烷基硫酸钠（SDS）和潮霉素 B（HygB）超敏反应的高通量筛选方法，最终得到最佳突变体 ArDWF1，产量达 46.72 mg/L，比对照菌株高 3.46 倍。

操纵甾醇稳态，提高代谢通量

细胞内，甾醇的生物合成在转录、翻译和翻译后水平上受到反馈调节，以严格控制细胞内甾醇含量。此外，为了减轻细胞毒性，过量的游离甾醇（包括上游甾醇和下游甾醇）会被酰化并储存在脂滴（LD）中。因此，胞内甾醇并非越多越好，提高甾醇的最终产量，必须要面对这一系列“此起彼伏”式的问题。

LDs 和细胞膜之间的甾醇稳态，取决于两种内质网定位的酰基辅酶A（甾醇酰基转移酶 ARE1 和 ARE2）和三种甾醇酯水解酶（YEH1、YEH2 和 TGL1）。后三者能够水解所有甾醇酯；而 ARE1 主要使早期甾醇（例如羊毛甾醇）酰化，ARE2 主要有助于晚期甾醇（如麦角甾醇）的酰化。

▲图 | 酵母中 24-epi-ergosterol 的合成、储存与水解

为了评估这5种酶对甾醇代谢的贡献，研究人员对这 5 个基因 ARE1、ARE2、YEH1、YEH2 和 TGL1 中的每一个进行了敲除或过表达。尽管 ARE1 的缺失或 ARE2、YEH1 和 YEH2 的过表达有利于 24-epi-ergosterol 的生物合成，但单基因操作的改善相当有限，表明还需同时进行甾醇酰化和水解工程来重建甾醇稳态。

正如预期的那样，同时过表达酰基转移酶基因（ARE2）和水解酶基因（YEH1 和/或 YEH2）表现出协同效应。具体地说，过表达 ARE2、YEH1 和 YEH2 的 YQE717 菌株，产生了 71.04mg/L 的 24-epi-ergosterol 和 220.07mg/L 的晚期甾醇，分别比对照菌株 YQE231 高 1.65 倍和 2.09 倍。

值得注意的是，引入额外的 YEH1 或 YEH2 表达盒未能进一步增加 24-epi-ergosterol 或总晚期甾醇的产量。另外，尽管 ARE1 失活的 YQE722 菌株亦产量可观，但其在补料分批生物反应器中的性能（细胞生长和产物形成）受到不利影响，特别是在乙醇发酵阶段。

▲图 | 基因 ARE1、ARE2、YEH1、YEH2 和 TGL1被过表达和/或敲除，单独和组合评估其对 24-epi-ergosterol 和其他晚期甾醇产生的影响

发酵 120 小时后，YQE717 菌株的细胞密度达到每升干细胞重量 186.05g，而 YQE722 为 153.36g。YQE717 的 24-epi-ergosterol 产量达 2.15g/L。

为了验证以上甾醇稳态工程对增加 24-epi-ergosterol 产量的贡献，研究人员分析了菌株中未酰化甾醇的百分比，观察到 ARE2、YEH1 或 YEH2 的单独过表达既不增加也不减少未酰化甾醇的百分比；另一方面，该三者同时过表达保持了与对照菌株相当的酰化比，表明了甾醇酰化和水解的平衡重建，而 ARE1 的失活则扰乱了这种平衡。这些结果突出了甾醇稳态的重要性。

此外，研究人员进行了定量 PCR 以确定对照菌株 YQE231 和 YQE717 中 ARE2、YEH1 和 YEH2 的相对转录水平。结果表明，目标产物产量的增加是由于这三个基因转录水平的增强，或酵母中重建的甾醇稳态。

考虑到乙醇发酵阶段甾醇的积累，乙醇诱导型启动子驱动这三个基因的表达可能也导致 24-epi-ergosterol 产量增加。因此，又研究了三者在不同启动子组合下的驱动。据此，选择了表现最佳的菌株（依旧为原始的 YQE717）进行进一步的关于启动子的代谢工程研究。

通过以上操作，24-epi-ergosterol 产量显著提高，但在其从头合成的反应中，反应底物仍然维持在较高水平，不仅降低了目标产物的浓度，还增加了纯化成本。

为此，研究人员评估了驱动 ArDWF1 突变体（Ar207）的启动子以及具有不同启动子的菌株在补料分批生物反应器中的性能，最终构建了产量达 2.76g/L 的菌株。

针对该研究中的不足——24-epi-ergosterol 的反应效率仍不尽人意，研究人员计划在未来使用 AlphaFold2 模型预测 ArDWF1 的三维结构以进一步提高转化效率。