Plant Cell | 上海交通大学林文慧研究组揭示拟南芥雌配子体发育调控新机制

雌配子体发育的调控机制是植物生殖生物学的关键问题，也是影响种子数量的重要因素之一。在拟南芥中，已知雌配子体发育与雌配子体中的大液泡形成密切相关。在雌配子体发育2期 （FG2） ，即雌配子体完成第一次核分裂后不久，一些小液泡开始在雌配子体的不同位置出现，并于FG2期晚期在雌配子体中央融合，形成一个较大的液泡，促进雌配子体膨大。之后液泡扩增形成一个显著的中央大液泡，此液泡将此时的两个核分别推向胚珠的合点端和珠孔端。正确的核迁移和核定位对雌配子体的极性形成以及雌配子体中各细胞核的命运都具有决定性作用 （Christensen et al., 1997） 。虽然这个现象在多年前已经发现，但对于雌配子体中大液泡形成的调控机制、以及大液泡形成如何影响雌配子体发育研究极少。曾有报道，定位在小囊泡和液泡膜上并促进小囊泡合并形成大液泡的VACUOLELESS GAMETOPHYTES （VLG） 基因的功能缺失会引起雌配子体中大液泡形成异常、导致雌配子体败育 （D'Ippólito et al., 2017） ，但VLG基因如何被调控未见报道。

近日，上海交通大学生命科学技术学院林文慧研究组在The Plant Cell在线发表了题为Spatiotemporal formation of the large vacuole regulated by the BIN2-VLG module is required for female gametophyte development in Arabidopsis的研究论文。该研究发现，雌配子体中大液泡在正确时空形成对雌配子体发育至关重要，大液泡在雌配子体单核期时提前形成或者在二核期时无法形成都会导致雌配子体败育。该研究阐明了GSK3类蛋白激酶BRASSINOSTEROID INSENSITIVE2（BIN2）通过与VLG相互作用并磷酸化VLG从而调控VLG蛋白的稳定性，影响雌配子体中大液泡的形成进而影响雌配子体发育的机制。该研究发现了BIN2蛋白的新功能，并提出了雌配子体发育调控的新机制。

该研究首先发现BIN2的功能获得性点突变体bin2-1的雌配子体在FG1期过早形成大液泡，过表达BIN2能够模拟bin2-1突变体的表型；而BIN2的功能缺失突变体bin2-3 bil1 bil2（BIN2与两个与之功能冗余的基因同时缺失的三突变体）导致FG2期之后大液泡形成异常；两者都使雌配子体发育异常，表明BIN2活性增加或降低都会影响雌配子体中的大液泡正常形成，进而影响雌配子体的发育。转录水平和蛋白水平检测都显示BIN2在雌配子体中表达，并与小囊泡状结构的标记蛋白部分共定位，推测BIN2可能定位在小囊泡状结构上，参与雌配子体中大液泡的形成。

BIN2影响雌配子体中液泡形成以及雌配子体发育

接着作者通过生化实验证明BIN2与VLG蛋白互作，VLG的蛋白丰度在bin2-1中显著提高，在bin2-3 bil1 bil2中显著降低。进一步研究表明BIN2能够稳定VLG蛋白，使其免受26S蛋白酶体降解。遗传实验表明在bin2-1中特异敲低VLG抑制大液泡在FG1期提前形成，在野生型中特异过表达VLG可诱导大液泡在FG1期提前形成，在bin2-3 bil1 bil2三突中表达ProVLG：VLG-GFP能够部分回复雌配子体发育缺陷的表型，表明VLG处于BIN2下游，并且BIN2通过VLG调控大液泡形成和雌配子体发育。蛋白结构预测以及质谱分析发现VLG蛋白序列上具有可被BIN2磷酸化的潜在位点，暗示BIN2可通过磷酸化稳定VLG蛋白。模拟去磷酸化作用的点突VLG产生与VLG缺失突变体类似的表型，模拟持续磷酸化作用的点突VLG和特异过表达VLG产生BIN2活性增加的表型，进一步证明BIN2通过磷酸化稳定VLG、调控雌配子体中大液泡的时空形成、进而影响雌配子体发育。

BIN2-VLG模块调控大液泡形成和雌配子体发育的工作模式图

综上，在野生型拟南芥的雌配子体中，VLG蛋白的合成和降解处于稳态，大液泡在正确的发育时期和位置形成，保障雌配子体正常发育；BIN2活性增加促进VLG蛋白稳定，使其丰度提高，触发大液泡在FG1期提前形成；BIN2活性缺失导致VLG蛋白稳定性下降，使其丰度降低，影响FG2期之后大液泡的形成，这两种情况均导致雌配子体发育停滞、核降解以及雌配子体败育。由此可知，BIN2-VLG模块介导的雌配子体中大液泡的正确时空形成对雌配子体发育至关重要。

上海交通大学博士后胡利芹和于世霞为论文第一作者，上海交通大学生命科学技术学院研究员林文慧为论文通讯作者，复旦大学生命科学院王应祥教授和上海交通大学农业与生物学院薛红卫教授参与了研究工作。此项工作获得了国家自然科学基金以及上海市现代种业协同创新中心的项目资助。

值得一提的是，林文慧研究组此前发表在Frontiers in Plant Science上的研究论文“Tonoplast Proton Pumps Regulates Nuclear Spacing in Female Gametophytes Via Polar Auxin Transport”显示，拟南芥液泡膜质子泵缺失造成雌配子体中的中央细胞核与卵细胞核间距增加 （中央细胞核与珠孔的距离增大） ，胚乳发育迟缓，部分种子败育，推测突变体中央细胞核定位异常与中央细胞大液泡形成有关；进一步研究发现液泡膜质子泵突变体的雌配子体中生长素信号下降，回补生长素能回复突变体中央细胞核与卵细胞核间距增大的表型。液泡膜质子泵-生长素-雌配子体发育三者的相关性值得进一步研究。上海交通大学生命学院博士生姜雨彤、上海交通大学致远学院本科生郑霁轩为该论文第一作者，上海交通大学生命学院研究员林文慧为论文通讯作者，日本东京传艺大学Ali Ferjani教授参与了研究工作。上述两项工作都表明液泡与液泡膜蛋白是雌配子体发育的关键调控因子，研究液泡相关的雌配子体发育调控机制以及液泡相关机制与其他已知机制特别是激素调控机制之间的关联具有重要意义。

参考文献：

Christensen, C.A… Drews, G.N. (1997). Megagametogenesis in Arabidopsis wild type and the Gf mutant. Sexual Plant Reproduction 10: 49-64.

D'Ippólito, S…Fiol, D.F. (2017). The DC1-domain protein VACUOLELESS GAMETOPHYTES is essential for development of female and male gametophytes in Arabidopsis. Plant J 90: 261-75.

Jiang, Y.T…Luan, S. and Lin, W.H. (2020). Two tonoplast proton pumps function in Arabidopsis embryo development. New Phytol 225: 1606-17.

Jiang, Y.T... and Lin, W.H. (2021). Multiple functions of the vacuole in plant growth and fruit quality. Molecular Horticulture 1: 4.

Jiang, Y.T., Zheng, J.X…Lin, W.H. (2022). Tonoplast proton pumps regulate nuclear spacing of female gametophytes via mediating polar auxin transport in Arabidopsis. Front Plant Sci 13: 1006735.

https://doi.org/10.1093/plcell/koad007