R-loop免疫反应激活机制

撰文 | 十一月

loop是含有RNA-DNA的杂合核酸，具有多种重要的细胞作用。R-loop的动态调节异常会导致DNA损伤和基因组不稳定【1】。研究表明R-loop的调节可能与XPG等内切酶活性相关【2-4】。但是目前R-loop的动态调节机制以及出现错误调节后所引发的细胞内后果仍不清楚。

近日，美国斯坦福大学 Karlene A. Cimprich研究组在Nature发表了文章R-loop-derived cytoplasmic RNA–DNA hybrids activate an immune response，发现在细胞质中存在一种新型R-loop，是R-loop加工过程中的产物。此类R-loop会作为免疫原导致免疫反应激活，这一过程会导致的许多疾病的发生。

R-loop在转录过程中形成的三链核酸结构，计划外的R-loop会干扰DNA复制和转录，并与多种疾病状态中双链断裂、基因组不稳定、衰老和细胞死亡等有关。人类细胞中存在抑制R-loop形成的因素，比如解旋酶SETX能够等解开R-loop的杂交环区域，另外乳腺癌易感基因BRCA1也参与到R-loop的调节之中。

为了研究R-loop的加工过程，作者们使用了GFP标记的重组催化失活型Rnase H1（GFP-dRH）对RNA-DNA杂交进行可视化研究【5】。作者们发现在敲除SETX或者BRCA1后，会导致细胞中RNA-DNA杂交体信号增加。这说明在细胞质中RNA-DNA杂交体在细胞质中累积（图1）。为了进一步对这一杂交核酸进行表征，作者们开发了一种对RNA-DNA杂交体可视化标记的生物化学方法称为cytoDRIP，使用该方法作者们进一步地证实了SETX或BRCA1的缺失以及剪接抑制剂PlaB处理会导致RNA-DNA杂交片段累积。

为了进一步追踪累积的RNA-DNA杂交体的来源，作者们分别对对照组细胞和SETX缺失型细胞将cytoDRIP以及链特异性RNA-DNA杂交体相结合进行测序。作者们在对照组细胞中鉴定出866个峰，在SETX缺失型细胞中鉴定出5726个峰。大多数的位点对Rnase H处理具有敏感性。在基因内，大多数cytoDRIP位点发生在基因体中；而在基因间区域，增强子则具有RNA-DNA杂交体信号的显著富集。另外，作者们还发现简单重复序列和低复杂度重复序列、着丝粒和rDNA等区域细胞内R-loop出现的概率会明显升高。因此，累积出现的RNA-DNA杂交体来源于基因组，且具有一定的富集特征。

进一步地，作者们检测了细胞质中出现的R-loop的稳定性，发现这些R-loop的半衰期是43-67分钟。随后，作者们发现RNA-DNA杂交体会引发细胞中的先天性免疫反应，激活IRF3信号途径并诱导细胞凋亡。为了测试当R-loop被诱导时，哪些先天免疫传感器介导IRF3的激活，作者们在SETX敲除型细胞中分别敲除了TLR3、RIGI、MDA5或cGAS，发现抑制cGAS和TLR3能够强烈降低磷酸化的IRF3以及下游效应因子，但是抑制RIGI或MDA5的影响并不大。这些结果表明R-loop诱导的IRF3信号主要是由cGAS和TLR3介导的。

最后，作者们想知道IRF3信号是否会由病理条件下累积R-loop所触发。为此，作者们使用了神经退行性疾病共济失调眼动失用症AOA2患者中的细胞株，该患者具有SETX突变功能丧失，以及另外一个来自于BRCA1突变的人卵巢癌细胞株。这两个细胞株中RNA-loop会出现显著增加。在自身变异疾病Aicardi Goutières syndrome中，细胞质中RNA-DNA杂交体增加，也会造成免疫反应和凋亡的增加。总之，在几种人类疾病模型中可以观察到R-loop加工过程中诱导产生的细胞质RNA-DNA杂交体的积累会导致队后先天免疫反应和细胞凋亡的激活。

总的来说，作者们的工作发现R-loop加工过程中会在细胞质中产生RNA-DNA杂交体累积，这一累积过程依赖于内切酶。作者们发现内源性细胞质RNA-DNA杂交体被免疫受体cGAS和TLR3感知，引发先天性免疫反应和细胞凋亡。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-022-05545-9

制版人：十一

参考文献

1. Crossley, M. P., Bocek, M. & Cimprich, K. A. R-loops as cellular regulators and genomic threats. Mol. Cell 73, 398–411 (2019).

2. Sollier, J. et al. Transcription-coupled nucleotide excision repair factors promote R loopinduced genome instability. Mol. Cell 56, 777–785 (2014).

3. Makharashvili, N. et al. Sae2/CtIP prevents R-loop accumulation in eukaryotic cells. eLife 7, e42733 (2018).

4. Cristini, A. et al. Dual processing of R-loops and topoisomerase I induces transcription dependent DNA double-strand breaks. Cell Rep. 28, 3167–3181 (2019)

5. Crossley, M. P. et al. Catalytically-inactive, purified RNaseH1: a specific and sensitive probe for RNA-DNA hybrid imaging. J. Cell Biol. 220, e202101092 (2021)