Plant Physiology | 北京林业大学宋跃朋课题组揭示杨树叶片形态自然变异的遗传基础

近日，北京林业大学生物学院宋跃朋教授课题组在Plant Physiology发表了题为“Enhanced genome-wide association reveals the role of YABBY11-NGATHA-LIKE1 in leaf serration development of Populus”的研究论文。该研究以叶形差异显著的毛白杨与小叶杨种质资源群体为材料，通过持续同调 （Persistent homology） 拓扑数据分析方法完成叶片形态特征的高通量量化，利用全基因组关联分析策略，对调控毛白杨与小叶杨叶形变异的关键基因定位。研究发现植物特异的叶片发育调控转录因子YABBY11与杨树叶形自然变异显著关联。基因功能解析表明在毛白杨基因组中YABBY11携带提前终止位点 （PtoYAB11PSC） ,致使其锌指结构域缺失，进而丧失对下游靶基因PtoNGAL-1与PtoRBCL的转录激活作用，导致叶片边缘的锯齿加剧、面积增大、光合利用效率提升。

叶片的形态特征是影响植物形态结构、产量以及果实品质等重要经济性状的关键因素。通常更宽更薄的叶片具有更高的光合利用效率与气体交换能力。因此，探索植物理想叶形形成的分子机制并实现遗传改良是植物育种学研究的一个巨大挑战。相对于植物的其他形状，叶形的变异较为显著，并且受年龄效应与环境效应的影响显著。叶片形状的形成取决于叶片相对于中轴的正面和背面的发育过程。已有的研究表明，该过程涉及一个植物激素、转录调控以及转录后调控等多层级的遗传调控网络。尽管，在高等植物中鉴定出了一些调控叶片形态的候选基因以及miRNA，但是，调控叶片自然变异的关键基因尚未见正式报道。

图1 杨树自然群体叶形变异显著

杨树叶片形态变异丰富，在种间与种内都存在显著的自然变异。为解析杨树叶片形态自然变异的遗传学基础，研究者利用两种叶形显著差异的杨树——毛白杨与小叶杨种质资源群体为研究材料。利用持续同调拓扑数据分析方法将杨树叶片形态量化为112个表型值。其中，54%的叶片表型性状广义遗传力大于0.4，属于中高遗传力性状。GWAS结果显示在毛白杨群体中有138个SNP位点与9个叶片表型显著关联，在小叶杨群体中，有171SNPs位点与8个叶片表型显著关联。在两个关联群体中，基因型-表型关联显著性最高的SNPs均位于YABBY11基因上。候选基因序列分析表明在毛白杨群体中，YABBY11携带提前终止位点（PtoYABBY11PSC），提前终止的氨基酸序列与DNA结合的锌指结构域完全丢失，仅保留了核定位信号。研究者选择YABBY11为候选基因构建杨属系统发育树，结果显示提前终止位点仅存在白杨派中，暗示了YABBY11PSC可能是一个白杨派特异的基因变体。

为阐明PtoYABBY11PSC携带的提前翻译终止位点是否改变了YABBY11下游的转录调控网络，研究者利用表达数量性状位点定位策略（eQTNs）分别对毛白杨和小叶杨群体YABBY11核酸变异与表达量进行分析。在毛白杨群体中，97个SNPs与55个基因表达量显著关联，其中包括与7个基因形成的42个cis-eQTNs以及48个基因形成的65个trans-eQTNs。在小叶杨群体中，共发现61个SNPs与52个基因形成表达量显著关联，其中包括与10个基因形成的27个cis-eQTNs 以及42个基因形成的44个trans-eQTNs。通过对下游靶基因功能注释，显示PtoYABBY11PSC与PsiYABBY11下游转录调控网络基因显著不同，暗示PtoYABBY11PSC携带的提前翻译终止位点已经显著改变了毛白杨YABBY11下游的转录调控网络。

由于PtoYABBY11PSC锌指结构域缺失，并且下游转录调控网络显著改变。研究者利用无细胞翻译系统以及DAP-seq技术，对具有完整转录因子结构的PsiYABBY11下游靶基因进行筛选，结果显示在164个基因上共筛选到220个PsiYABBY11互作位点，其中37.5%的互作位点位于转录起始位点以前2000bp范围内。对PsiYABBY11下游靶基因进行KEGG通路注释，结果表明其下游靶基因主要富集在photosynthesis, oxidative phosphorylation, starch and sucrose metabolism, 以及 ribosome等通路中。联合eQTNs与DAP-seq分析结果，共筛选出NGAL1, RBCL, PHOTOSYSTEM II REACTION CENTER PROTEIN B (PSBB), ATP SYNTHASE SUBUNIT ALPHA (ATPA)以及ATP SYNTHASE EPSILON CHAIN (ATPE) 基因为PsiYABBY11的下游靶基因。利用酵母单杂交与凝胶迟滞实验进一步进行验证，证明PsiYABBY11可以和NGAL1 与RBCL基因的启动子直接结合。双荧光素酶实现表明PsiYABBY11可以激活NGAL1 与RBCL基因表达。进一步利用酵母单杂实验证明了NGAL1与其下游生长素响应靶基因CUC2在杨树基因组也存在相互作用。该结果表明，YABBY11-NGAL1-CUC2 可能通过调控杨树叶边缘发育进而导致叶片形态的自然变异。

为进一步解析PtoYABBY11PSC与PsiYABBY11的分子功能，利用农杆菌介导的方法，对PtoYABBY11PSC与PsiYABBY11进行过量表达，结果显示PtoYABBY11PSC-OE植株叶长、叶宽、叶面积显著增加，光合作用效率显著提升，叶片边缘锯齿显著加剧。PtoYABBY11PSC-OE植株叶长、叶宽、叶面积显著减小，光合作用效率降低，叶片边缘光滑，但是叶脉厚度与气孔密度显著增加。为进一步验证PtoYAB11PSC的功能，研究者利用毛白杨群体基因组数据，在PtoYAB11PSC仅有的174bp范围内排除SNPs的干扰，设计gRNAs，利用Cas9编辑系统实现了PtoYAB11PSC敲除（PtoYAB11PSC-KO）。PtoYAB11PSC-KO植株显示叶片边缘光滑，但是光合作用效率与叶片面积没有显著改变。

图 2 PsiYABBY11与PtoYABBY11PSC分子功能解析

综合以上研究结果表明，在杨树基因组中，YABBY11通过反式调控作用激活NGAL1表达上调，进而抑制CUC2基因表达，调控光滑叶缘的形态发育。同时，YABBY11 激活RBCL基因表达，导致Rubisco大小链装配失调，进而光合作用效率显著下降。而在白杨派树种中，YABBY11PSC由于携带翻译提前终止位点，丧失了对NGAL1-CUC2模块以及RBCL基因的转录调控作用，进而导致叶片面积增大、叶片锯齿加剧、光合作用效率提升。此外，YABBY11基因在毛白杨与小叶杨基因组中均对环境胁迫响应信号响应敏感，暗示了YABBY11-NGAL1-CUC2模块可能是基因组与外界环境信号互作调控叶形变异的关键分子调控模块。该模块为系统了解叶形响应外界环境信号产生自然变异提供了一个全新的视角，为探索理想叶形遗传改良奠定了理论基础。

图 3 杨属YABBY11调控叶形自然变异的分子机制

北京林业大学生物科学与技术学院硕士研究生刘鹏与博士研究生卜琛皞为论文共同第一作者，宋跃朋教授为通讯作者，陈盼飞博士以及英属哥伦比亚大学的Yousry A. El-Kassaby教授参与了该研究，林木分子育种团队负责人张德强教授给予该工作总体指导。该研究得到了国家重点研发计划项目、国家林业和草原局青年拔尖人才项目以及国家自然科学基金项目以及111引智计划等项目资助。

论文链接：

https://doi.org/10.1093/plphys/kiac585