江南大学许菲｜基于计算设计合成的胶原蛋白能够促进成骨细胞分化

如今，AI 能够精准预测和设计单个或多个亚基组成的蛋白质三维结构，然而自然界中很多蛋白质是由众多亚基组合形成的超分子组装体，蛋白质超分子组装体的计算、预测与设计仍然是领域内具有很大挑战性的难题。

以人体内分布最广泛的、含量最高的蛋白质——胶原蛋白为例，天然胶原蛋白可以从动物组织中进行提取，但是存在安全性和纯度问题，限制了其作为生物材料的广泛应用。

相较之下，合成胶原蛋白能够避免这些问题，然而科学界对于合成胶原蛋白的超分子结构形成机理所知甚少，难以在分子水平构建出与天然胶原相同的折叠和超分子组装成有序的带状纤维，合成胶原蛋白的设计仍然面临挑战。

近期，由江南大学、同济大学以及美国罗格斯大学组成的联合团队，设计并制备出一种可自发组装形成带状纤维的合成胶原蛋白，并且通过细胞试验证明该合成胶原蛋白具有与天然 Ⅰ 型胶原相当的、促进成骨细胞分化的能力，今后有望为制备具有高生物安全性与功能性生物材料提供一种简便可用的胶原蛋白原料。目前，这项研究论文已经以“Design of synthetic collagens that assemble into supramolecular banded fibers as a functional biomaterial testbed”为题发表在 Nature Communications 上。

（来源：Nature Communications）

“在本研究中我们设计并制备出一种与天然 Ⅰ 型胶原纤维类似的、带有凹凸条纹的胶原蛋白纤维，未来不仅可以通过此设计来了解天然胶原蛋白的组装机制，还能够通过掌握这些设计规则来制造具有特定功能的新型生物医用材料。”该论文通讯作者、江南大学生物工程学院许菲教授告诉生辉。

▲图｜江南大学生物工程学院许菲教授（来源：受访者）

2000 年，许菲在武汉大学本科毕业之后，赴美国罗格斯大学攻读博士学位，师从 Wilma K. Olson 教授，进行核酸分子的计算结构生物学研究。随后她进入罗格斯大学先进生物技术及医学中心从事博士后研究工作，师从 Vikas Nanda 教授，研究蛋白质与多肽的计算设计与结构验证。从 2015 年起，她进入江南大学生物工程学院担任教授，组建科研团队并专注于纤维状蛋白与多肽、工业酶的计算设计、结构与功能验证方面的研究。

截至目前，许菲以通讯/第一作者在 PNAS、Journal American Chemical Society、Journal of Biological Chemistry、Nucleic Acids Research 等期刊发表了 19 篇研究论文，拥有 6 项专利授权，软件著作权 1 项，此外，她还曾主持国家自然科学基金项目、国家重点研发计划课题，获得江苏省双创人才、江苏省特聘教授、六大高峰人才等奖项。

成功设计与合成胶原蛋白，验证其可促进成骨细胞分化

作为人体内分布最广泛的蛋白质，胶原蛋白除了是皮肤的主要支架蛋白之外，也是眼角膜与心脏等器官的主要支架蛋白，其具有促进骨骼形成、维护器官与组织完整性等生理功能，同时还参与血栓形成、肺部纤维化、肿瘤细胞迁移等多种病理过程。

理论层面，早在上世纪五十年代科学家就通过 X 射线衍射实验表征了天然胶原蛋白具有三重螺旋的二级结构。“然而科学界对胶原蛋白超分子组装机理，即数百个三重螺旋是在何种作用力驱动下、又是如何形成带有规则凹凸条纹的微米级纤维的原理与过程了解有限。”许菲表示。

应用层面，天然胶原蛋白作为医用生物材料的历史最早可追溯到 1881 年，是手术缝合线和止血海绵等传统医用材料的主要成分，而在现代组织工程研究，天然胶原蛋白是诸如 Matrigel 等广泛使用的细胞 3D 培养基的主要成分。“但是目前市场上的天然胶原蛋白相关产品通常是从动物皮肤与跟腱等组织中提取的，不同的提取来源会影响质量与纯度，更令人担忧的是还可能被来源动物带有的病原物污染。”许菲指出。

如今，通过合成生物学技术制备胶原蛋白来替代天然提取的胶原蛋白是医用生物材料发展的未来方向。在许菲看来，“虽然目前能够利用原核或真核工业微生物底盘细胞重组表达胶原蛋白基因，但是难点在于，无法在微生物底盘细胞内外精确重现从合成到组装过程，导致重组表达的胶原蛋白无法自组装形成与天然 Ⅰ 型胶原蛋白类似的、具有凹凸条纹的微米级纤维。”

“蛋白质设计技术始终为两个方面的研究服务，其一，是探索蛋白质折叠与组装的底层原理；其二，为实现更优的生物功能。”谈及开展这项研究的初衷，许菲说道，“不论是在对蛋白质折叠与组装的理论研究方面，还是在生物医学材料的应用方面都存在挑战，所以我们着手启动了此次研究与探索。”

▲图｜采用模块化设计策略构建的合成胶原蛋白与天然 Ⅰ 型胶原蛋白的组装层次结构（来源：Nature Communications）

据介绍，在多种胶原蛋白类型之中，占比最大的为 Ⅰ 型胶原蛋白，它是一种具有分层级组装、纤维状的超分子结构，其中每条单链由约 1000 个氨基酸残基构成，三条单链折叠形成三重螺旋的二级结构，数百个三重螺旋分子自发组装形成具有凹凸条纹的蛋白纤维，而超分子结构对其发挥生理功能起到重要作用。

在这项研究中，许菲团队采用模块化、分层级的计算设计策略来“组装”合成胶原蛋白，使其具有与天然 Ⅰ 型胶原纤维类似的形貌。首先，他们通过构建胶原分子界面的相互作用模型并优化结合自由能，从而设计出一系列可以驱动超分子组装的粘性模块；然后，他们把粘性模块放置在功能模块两端，从而能够促使胶原蛋白分子以首尾衔接的方式进行自组装；最后，他们基于扩散限制性聚集的粗粒化模型，模拟了从纳米级分子到微米级纤维的组装过程。“我们计算模拟的胶原蛋白纤维是一种中间粗、两端细的长梭形三维结构，粘性模块聚集形成高原子密度的部分，而功能模块形成低原子密度的部分。”许菲指出。

接下来，许菲团队采用基因重组技术通过大肠杆菌（E.coli）表达系统制造出他们设计的这种胶原蛋白，冷冻电子显微镜成像显示该胶原蛋白形成了与天然 Ⅰ 型胶原纤维类似的、带有凹凸条纹的纤维结构，而通过粘性模块与功能模块的序列长度，条纹的宽度也随之改变，这进一步验证了其组装机理。随后，他们还借助细胞学试验初步验证了这种设计的胶原蛋白能够促进成骨细胞分化。

▲图｜由合成胶原蛋白的带状纤维诱导成骨细胞前体细胞的增殖、粘附和成骨细胞分化（来源：Nature Communications）

对于合成胶原蛋白序列与天然 Ⅰ 胶原蛋白序列存在的差异，许菲表示，“与天然 Ⅰ 型胶原序列相比，合成胶原蛋白的序列更短，合成胶原蛋白序列的中间带有一段 80-240 个残基的功能模块，两端分别带有 30-36 个残基的、富含脯氨酸的人工设计序列。此外，对于这种合成胶原蛋白，我们已经取得了专利授权。”她补充说。

总的来说，许菲团队的这项研究通过多尺度、分层级的计算建模方法设计并制备了一系列胶原蛋白序列，可自发组装形成一种与天然 Ⅰ 型胶原纤维类似的胶原蛋白纤维。未来，这种合成胶原蛋白不仅可作为一种新型的骨缺损修复材料，还将为研究成骨不全症等胶原相关疾病提供一个可定制、可调控的纳米平台，加深对其致病机制的理解。

提高合成胶原纤维力学强度，拓展其作为生物材料应用

谈及在开展这项研究过程中遇到的挑战，在许菲看来，“目前蛋白质设计主要关注球状蛋白，以设计单域蛋白折叠最为成熟。而针对设计纤维状蛋白的计算设计工具较少，更鲜有人涉足纤维状蛋白超分子组装体的设计，即如何使单域蛋白之间发生界面作用，使数百上千的单域蛋白发生聚集。”

据介绍，对于胶原蛋白的合成，领域内有两种完全不同的技术路线。第一种是不断完善微生物底盘细胞，比如共表达脯氨酸羟化酶等，深入开发使其能够更贴近天然胶原从合成到组装的一系列过程。“基于蛋白质设计的研究基础，我们团队利用第二种技术路线，即绕过复杂的天然合成与组装路线，设计全新的蛋白质，以不同自发组装方式形成与天然胶原纤维形貌类似的蛋白纤维。”许菲说道。

▲图｜合成胶原纤维的冷冻电镜成像（来源：Nature Communications）

“我们采用了模块化的设计策略，设计的粘性模块负责界面相互作用，功能模块负责带有生物功能。与之前设计的胶原样多肽相比，现在设计的、带有多个模块的胶原蛋白具有更大的分子尺寸，可增加在溶液中分子间碰撞的可能性，促进粘性模块间的相互作用。”许菲表示。

相较于天然 Ⅰ 型胶原蛋白，“合成胶原蛋白作为一种新型的骨缺损修复材料具有质量稳定、生物安全性高的优点，但是合成胶原最具潜力之处在于，可基于生物功能的需求修改源头序列，比如嵌入与整合素等细胞因子相互作用的位点。”许菲指出，“当然，现阶段也并非完美，这种合成胶原蛋白的力学性能还有待提高，目前只能做为涂层，还不能形成水凝胶。”她补充说。

回顾这项研究，许菲坦言，“对于面临的挑战，与其说是技术攻关，不如说是水到渠成。”据介绍，她从 2007 年便开始从事胶原样多肽的计算设计，研究可以导致胶原三螺旋内折叠与三螺旋间组装的相关作用力；从 2015 年起进入江南大学组建科研团队，基于之前的理论积累，把研究目标物从比较理论的胶原样多肽扩展到序列更长、结构更复杂、功能更多样的胶原蛋白。

▲图｜许菲教授课题组成员（来源：受访者）

对于接下来的研究动向，许菲表示，“我们将提高合成胶原纤维的力学强度，拓展在生物医用材料方面的应用，同时继续深入研究纤维状蛋白的折叠与组装机理、开发针对胶原蛋白的计算设计软件。目前已知的天然胶原蛋白分为 26 型，虽然二级结构均为三螺旋，但是具有如纤维状、哑铃状、网络状等形态各异的超分子结构，如何让重组胶原具有这些超分子结构是未来需要着力攻关的重点。”她总结说。