中药药理-if6-西南医科大学:微生物组和代谢组学的比较研究揭示茯苓中成分可调节肠道菌群

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导读

Wolfiporia cocos (F. A. Wolf) Ryvarden & Gilb，也被称为茯苓，是一种传统的食用和药用真菌，数千年来因其镇静、利尿和健脾的特性而受到重视。由于茯苓成分复杂，其药理作用尚未被完全阐明。因此，为了从药理学角度扩展我们对这些作用的了解，并利用药用真菌的潜在药用价值，我们从茯苓中提取了三种主要代谢物，包括水溶性多糖(PCX)、水不溶性多糖(PCY)和三萜皂苷(PCZ)，以探索这些成分对小鼠肠道菌群及其代谢组学的影响。菌群分析表明，PCY通过改变其组成和增加乳酸菌的数量对肠道菌群的调节作用最强（p < 0.01）。我们采用代谢组学方法共检测出1828种代谢物，结果表明，茯苓的三种主要活性代谢物显著改变了肠道代谢物中短链肽的含量。总之，我们的研究进一步探索了茯苓的药理功能，并揭示了其三种主要代谢物对肠道菌群的不同影响。结果表明，PCY是一种重要的益生元，为我们对真菌多糖在中药中的潜在开发提供了新的认识。

论文ID

原名：Three main metabolites from Wolfiporia cocos (F. A. Wolf) Ryvarden & Gilb regulate the gut microbiota in mice: A comparative study using microbiome-metabolomics

译名：茯苓的三个主要代谢物调节鼠肠道菌群：使用微生物组-代谢组的比较研究

期刊：Frontiers in Pharmacology

IF：5.988

发表时间：2022.08

通讯作者：宋璨&郭秀蓉

通讯作者单位：西南医科大学药学院

实验设计

实验结果

1. 小鼠总体数据

在适当条件下喂养15天后，与空白对照组相比，PCX、PCY和PCZ组小鼠的相对体重显著降低（补充图S1）。如补充图S2所示，与空白对照组相比，PCX、PCY和PCZ组小鼠的平均每日食物消耗率降低。这些结果表明口服茯苓减少了小鼠的饮食并促进了体重减轻。

图1 从茯苓中提取三种主要活性成分的方案

2. 多糖表征

总糖含量采用硫酸-苯酚法测定。PCX的总糖含量计算为80.48%。多糖的单糖成分采用离子色谱法测定。PCX由木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，本研究中PCY主要由葡萄糖组成（补充表S1）。

图2 (A)来自门水平小鼠粪便的16S rDNA测序数据中的细菌分类学分布。(B) 属水平的粪便菌群热图。(C)四组粪便菌群的PCoA分类得分散点图。(D) PCX和空白对照（CNT）组粪便菌群的PCoA分类的得分散点图。(E) PCY和CNT组粪便菌群的PCoA分类的得分散点图。(F) PCZ和CNT组粪便菌群的PCoA得分散点图。

3.对肠道菌群组成和结构的影响

我们对四种小鼠粪便细菌DNA中的16Sr RNA进行了高通量基因测序，测序数据充分反映了每个样本中菌群落的丰富度和均匀度。我们从32个粪便样本中总共获得了8,26,747个高质量读数（>200 bp），用于分类鉴定和多样性分析。四组的Ace、Shannon、Simpson、Shannoneven、Simpsoneven和覆盖多样性指数显示在补充表S2中，用于检查测序深度（Sobs指数）丰富度和共享生物扩增序列变体(ASVs)数量的稀疏曲线显示在补充图S3中。稀释性曲线可用于比较具有不同测序数据量的样品中的物种多样性，也可以用来解释样本的测序数据量是否合理。大多数样本达到了平台水平，这表明检测肠道微生物组基因的测序深度是足够的。PCX（303.3）和PCZ（297.3）的ASVs平均值高于CNT（288.1）；然而，用PCY (246.5)处理的小鼠的ASVs较低，所有差异均无统计学意义。

为了清楚地了解每组中所含的微生物以及每种微生物的相对丰度，我们使用群落条形图分析观察了四组在门水平上的肠道菌群落结构。如图2A所示，厚壁菌门、拟杆菌门、弯曲杆菌门、Patescibacteria、放线菌门、脱硫菌门和Deferribacterota是小鼠肠道菌群中存在的主要细菌门。在实验组和对照组中，厚壁菌门是最主要的肠道细菌群落，拟杆菌是第二大肠道细菌群落。我们创建了肠道菌群结构分布的热图，以确定PCX、PCY和PCZ处理的小鼠在属水平上肠道群落的差异（图2B）。该图以定义的颜色阴影直观地表示数据值的大小，丰度越高越暗，丰度越低越亮。与CNT组相比，PCY改变了小鼠肠道菌群的属水平，其中最丰富的细菌是乳酸杆菌、norank-f-Muribaculaceae、拟普雷沃菌和未分类的-f-Lachnospiraceae。

我们使用主坐标分析（PCoA）来可视化组间肠道菌群落结构和多样性的差异。四组PCoA图主要集中在区域的上部，PC1占29.20%，PC2占14.02%。如图2C所示，PCX组主要聚集在图的左侧，PCY组聚集在图的右侧，两组之间没有交集；相比之下，PCZ和CNT组分散而不聚集在特定区域。与图上的CNT组相比，PCX和CNT组位于图2D左右两个不同的区域；PCY组明显聚集在远离CNT组的区域（图2E），但PCZ和CNT在主要区域内相互交错，没有分开（图2F）。总的来说，结果表明肠道菌群结构的变化与施用茯苓多糖密切相关。

图3 (A)门水平粪便菌群的Kruskal-Wallis H检验条形图。(B)两组间门水平粪便菌群的Wilcoxon秩和检验条形图。(C)粪便菌群在属水平上的Kruskal-Wallis H检验条形图。(D)两组间粪便菌群属水平的Wilcoxon秩和检验条形图。(E)通过LEfSe分析获得四组的LDA分数。(F)由16S rRNA基因序列的LEfSe分析生成的分类进化枝图。

4. 肠道菌群比较分析

我们使用16S rRNA高通量测序在门水平定量测定小鼠肠道菌群落的变化；相对丰度<1%的门被排除在外。我们选择相对丰度最高的前10个门进行比较，如图3A所示。四组的肠道微生物类群在门水平上主要由厚壁菌门、拟杆菌门和弯曲杆菌门组成，与其他三组相比，PCX组中Deferribacterota的增加具有统计学意义（p < 0.05）。显然，两组之间的比较表明，在施用茯苓活性代谢物后，厚壁菌门与拟杆菌门的比例增加（图3B）。

为进一步研究这三种代谢物对四组属水平肠道微生物的影响，我们选择了相对丰度最高的10个菌种进行Kruskal-Wallis H检验；结果如图3C所示。与其他三组相比，PCY处理的小鼠的乳酸菌丰度显著增加(p < 0.01)。此外，在PCX组中给予水溶性多糖后，芽孢杆菌的丰度显著减弱。此外，我们还在属水平创建了Wilcoxon秩和条形图，以确定两组之间的差异（图 3D）。与CNT组相比，PCX增加了毛螺菌科的数量，减少了Muribaculaceae的数量。与CNT组相比，PCZ增加了乳酸杆菌和Muribaculaceae的数量，但这些结果均无统计学意义，并且只有PCY组的乳酸菌数量显著增加（p < 0.01）。

线性判别分析效应大小(LEfSe)分析是一种发现和解释高纬度数据标记的方法，以确定最能解释物种间差异的特征和这些特征的影响。在本研究中，我们比较了高维分类，检测了4个组之间细菌群落优势度的差异。根据预设值为2的每组细菌属的影响，线性判别分析（LDA）得分越高，在比较中越显著，反之得分越低，越不显著。如图3E、F所示，肠道菌群落的LEfSe分析表明，有20个菌种导致了四组之间的相对丰度差异，其中PCX贡献了12个细菌，PCY贡献了7个细菌，CNT贡献了1个细菌。导致肠道菌群变化的主要细菌是乳酸杆菌、梭状芽孢杆菌、另枝菌、Odoribacter、Lachnospiraceae_NK4A136_group和毛螺菌。此外，实验组和空白对照组之间的LEfSe条形分析结果显示在补充图S4-S6中。

图4 (A)四组小鼠代谢物的KEGG化合物分类。(B)四组小鼠代谢物的维恩图。(C)正离子模式下粪便样本代谢谱的PLS-DA评分图。(D)负离子模式下粪便样本代谢谱的PLS-DA评分图。

5. 对粪便代谢组学的影响

我们使用代谢组学方法共检测到1,828种代谢物。我们结合了KEGG、维恩图和PLS-DA来直接可视化四组在代谢特征方面的差异，并检测区分不同组的代谢物（图4）。KEGG化合物分类是根据代谢物所参与的生物功能的等级层次对其进行分类的一种方法。我们将四组小鼠的代谢物与KEGG化合物数据库进行比较，以获得代谢物分类概况，如图4A所示；22种物质在肠道代谢谱中占据主导地位，包括维生素、辅因子、类固醇、肽、有机酸、核酸、脂质、碳水化合物、抗生素、激素和递质。

如维恩图（图4B）所示，四组共有1,039种代谢物重叠，从而表明这些物质对它们来说是共同的；单独来看，CNT组只有两种独特的代谢物，PCZ组有六种独特的代谢物，PCX和PCY组各有三种独特的代谢物。

正离子模式和负离子模式下的PLS-DA评分图显示，小鼠接受不同组分处理后，各组的菌群组成有明确的分类（图4C，D），来自同一组的样本聚集在一起。负离子模式下前两种成分的百分比变化分别为16.7%和15.1%，正离子模式下分别为13.6%和16.2%。PCY和PCX组明显聚集在一起，PCX组最接近CNT组，而PCY和PCZ远离CNT组。结果表明，PCY对小鼠粪便的代谢组成有较大的改变。

图5 (A) PCX和CNT组之间代谢物的表达谱和VIP。(B) PCY和CNT组之间代谢物的表达谱和VIP。(C) PCZ和CNT组之间代谢物的表达谱和VIP。(D) PCX和PCY组之间代谢物的表达谱和VIP。*p < 0.05；**p < 0.01; ***p < 0.001水平时差异被认为具有统计学意义。

6.代谢组学比较分析

我们使用聚类热图和VIP条形图进行变量投影重要性(VIP)分析，通过对VIP数据和单维数据进行多元统计分析，详细分析了四组代谢物的表达模式和代谢物的p值；这种方法可视化差异代谢物的重要性和表达趋势变化。如图5A-C所示，这些代谢物分别主要参与氨基酸代谢、脂肪酸代谢和嘌呤代谢，短肽代谢物占每组前十代谢物的大部分。PCY和PCZ均显著增加LysoPE 0:0/16:1 (9Z)、Ile Leu His Ile、Crustecdysone和Ser Thr Thr Ala Val (p < 0.05)的含量。而PCX显著增加了EUPATORIOCHROMENE、1-甲基次黄嘌呤、(Z)-3-氧代-2-(2-戊烯基)-1-环戊烯乙酸，3,4,5-trihydroxy-6-{[(6E)-3-oxo-1,7-diphenylhept-6-en-1-yl]oxy} oxane-2-carboxyli和PC(P-16:0/0:0) (p < 0.05)。此外，VIP热图的得分图（图5D）揭示了PCY和PCX组在代谢物水平上的分离，共鉴定出九 种不同的短链多肽代谢物。

图6 (A) PCX和CNT组之间代谢和肠道菌科之间的相关性。(B) PCY和CNT组之间代谢和肠道菌科之间的相关性。(C) PCZ和CNT组之间代谢和肠道菌科之间的相关性。(D) PCX和PCY组之间代谢和菌科之间的相关性。连接表示强Spearman相关系数(ρ > 0.5)和显著(p值 < 0.05)相关。

7. 微生物组与代谢组的相关性分析

我们进一步推测，茯苓的活性代谢物可能通过细菌和代谢物之间的网络干扰肠道自然屏障。因此，我们分析了微生物组和代谢组学之间的相关性，以寻找细菌和代谢物种群的可能变化，并可能揭示细菌成分和复杂代谢物之间的关系。如图 6 所示，与CNT组相比，Marinifilaceae增加PCX组的PE (p-16:0e/0:0) 和 PE (p-16:0/0:0)并减少3b, 12a-二羟基-5a-胆酸的含量（图 6A）。在PCY组(图6B)，Oscillospiraceae增加3-formyl-6-hydroxyindole的产生并抑制异亮氨酰脯氨酸和胆酸的产生。Rikenellaceae也增加了利太林酸，减少了异亮氨酰脯氨酸。在PCZ组中（图6C），几乎所有细菌都与3-甲酰基-6-羟基吲哚、3b, 12a-二羟基-5a-胆酸和6-羟基-5-{[(3- hydroxy-2-oxo-2h-chrome-7-yl) oxy]methyl}-1,1,4a, 6-tetramethyl –呈正相关，并且与PE (p-16:0e/0:0)和PE (p-16:0/0:0)的数量呈负相关。PCX和PCY组（图6D）均包含多糖，它们的比较表明，螺杆菌科显著提高利太林酸，乳杆菌科显著提高胆酸水平，具有统计学意义（p < 0.01）。

图7 血清、肝脏和脾脏组织中肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素10 (IL-10) 和干扰素γ (IFN-γ)的水平。(A)肝组织中IL-10的水平。(B)脾组织中IL-10的水平。(C)血清中IL-10的水平。(D)肝组织中IFN-γ的水平。(E)肝组织中TNF-α的水平。(F)脾组织中TNF-α的水平。所有值均为平均值± SD，在*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001的水平上认为差异具有统计学意义。

8. 三种代谢物对细胞因子的影响

ELISA的结果如图7所示。与对照组相比，PCX显著提高小鼠肝组织（p < 0.01，图7A）、脾组织（p < 0.01，图7B）和血清（p < 0.001，图7C）中的 IL-10水平，PCY显著降低小鼠肝脏中的IFN-γ水平（p < 0.001，图 7D），PCZ降低了肝脏（p < 0.05，图7E）和脾脏（p < 0.01，图7F）组织中的TNF-α水平。PCX和PCZ还能促进干扰素γ(IFN-γ)免疫应答的分泌，增强先天特异性。此外，TNF-α和IFN-γ水平对PCX的反应没有显著差异，IL-10水平对PCY和PCZ的反应没有显著差异。我们的研究结果表明，来自茯苓的活性代谢物促进炎性细胞因子的产生，以增强脾脏和增强免疫力，尽管某些细胞因子的水平没有变化。

健康的肠道依赖于共生细菌、益生菌和病原体的平衡，尤其是益生菌，它们在调节肠道菌群方面发挥着重要作用。益生元是一类不被宿主消化的有机物质，通常通过增加肠道内有益菌的数量和减少致病菌的数量来健脾、增强免疫力。随着对生物分子的研究越来越多，一些多糖已被报道为益生元，可以持续对抗肥胖和改善代谢疾病。黄芩苷多糖维持肠道屏障的完整性，增加肠道菌群的多样性和丰富度。芦荟多糖可作为益生元，增加SCFAs产生菌的数量并促进一系列肠道功能。饮食干预、益生菌摄入和粪便菌群移植(FMT)在过去十年中已成为潜在策略，可用于将肠道生态失调逆转为体内平衡。这种方法似乎既新颖又必要。在草药和普通食品中，黄精叶中的多糖可调节肠道菌群，影响短链脂肪酸的产生，从而促进小鼠健康；海藻多糖通过富集具有褐藻糖胶降解能力的肠道菌种，在预防肥胖和肠道菌群失调方面表现出良好的潜力。在真菌中，灵芝多糖增加了肠道菌群中拟杆菌/厚壁菌的比例，促进了短链脂肪酸的产生；从桦褐孔菌中提取的多糖可以通过增加益生菌的相对丰度来调节肠道菌群；从茯苓中提取的水不溶性多糖可通过调节肠道菌群来改善小鼠的高血糖、高脂血症和肝脂肪变性。我们应该继续关注和研究人类肠道微生物组对食用真菌生物活性提取物的响应情况。茯苓是一种古老的食药用真菌，三种活性代谢物都发挥着不同的药用作用，从而降低小鼠的相对体重，影响肠道菌群，改变代谢物质。

我们的实验研究发现，将茯苓的三种有效物质给予小鼠后，微生物的组成和结构并不相同，PCY表现出最强的益生菌作用。PCoA结果表明不同组的肠道菌群之间存在统计学上的显著差异，并且同一组中的样本相似。PCX改变了小鼠肠道菌群的结构，PCY重塑了肠道微生物菌落的布局和结构；相比之下，PCZ组的肠道菌群结构没有明显变化，表明PCZ对小鼠肠道的影响可能很小，我们假设茯苓中的三萜类化合物作用于活体的其他系统和器官，例如心血管系统和免疫系统；这一假设与之前对三萜皂苷的研究一致。小鼠肠道菌群主要由厚壁菌门和拟杆菌门组成，占整个肠道菌群的近90%。这些物种与曲霉、梭状芽胞杆菌等细菌结合形成了一个完整的系统，这与以往大量研究的发现是一致的。在门水平上，厚壁菌门/拟杆菌门的比例被认为是肥胖的生物学指标之一，其变化与肥胖密切相关。根据一系列报道，芽孢杆菌和厚壁菌门含有大量的糖苷水解酶，它们显著影响多糖碳水化合物的降解，可发酵分解成各种短链脂肪酸。根据已发表的报道，乳酸杆菌和双歧杆菌等益生菌可以利用多糖产生代谢物，与肥胖密切相关。益生菌是对宿主有益的活性微生物，通过调节宿主黏膜和全身免疫功能或通过调节肠道菌群平衡、促进营养吸收来维持肠道健康。乳酸杆菌在属水平上具有潜在的健康益处，包括与减肥和改善代谢紊乱有关；因此，在过去十年中，它们在微生物学领域获得了大量研究。在科水平上，毛螺菌科和毛螺菌科-NK4A316组是主要丁酸产生菌，且属于厚壁菌门主要菌群；这表明多糖可以通过增加菌群中产生丁酸的比例来促进有益代谢物的合成，从而促进肠道健康。每种微生物的作用是不同的，不同的物质对微生物造成的影响也不同。由于不同的代谢物具有不同的物理性质和药理活性，微生物对膳食成分的反应也不同。在我们的研究中，微生物分析数据显示，PCY显著增加了乳酸杆菌的相对丰度，而PCX则相反地降低了乳酸杆菌的相对丰度。我们推测这可能是由于其特性，茯苓水不溶性多糖在肠道中受到乳酸杆菌的青睐。这些结果进一步证明PCY可以增加益生菌的相对丰度，重塑肠道生物群落结构，优化肠道屏障。

代谢组学结果表明，在服用茯苓的三种主要代谢物后，使用非靶向代谢组学测试的三组小鼠的粪便代谢物显示出显著不同的特征，在多种短链多肽代谢物中出现更大的变化。PCX、PCY、PCZ的短链多肽与CNT组相比显著增加，Miguel等人发现由Gly Ser Thr代谢组成的代谢hubs可能会影响与长寿相关的分子机制，这对人体是有益的。肠道代谢是一个复杂的过程，非靶向代谢组学分析肠道代谢的主要产物，包括氨基酸、脂肪酸和嘌呤。在本研究中，用茯苓的三种代谢物处理的小鼠中代谢物差异主要存在于短链多肽中。然而，肠道细菌群落主要将多糖分解为各种短链脂肪酸（SCFA）作为能量来源并调节肠道功能，而在本研究方法中可能无法检测到SCFAs的浓度。这可能是PCX和PCZ在不改变小鼠肠道菌群结构和组成的情况下导致肠道代谢物显著差异的原因。因此，我们推测PCX、PCY和PCZ都可以促进蛋白质的降解和消化。微生物组和代谢组学的相关性分析表明，茯苓的不同代谢物导致肠道微生物结构不同，不同组间微生物组的差异反过来又导致代谢物的差异，这与我们的猜想大体一致。

在用多糖和三萜皂苷处理后，小鼠通过产生炎性细胞因子如IL-10、TNF-α和IFN-γ来抵抗病原体入侵，它们是用于活化的巨噬细胞防御病原体的关键物质。IFN-γ主要由免疫1型t辅助细胞（Th1）产生非特异性免疫，IL-10是一种具有重要免疫调节功能的抗炎和多效性细胞因子。IL-10调控肠道微生物和食物抗原的慢性刺激，维持免疫系统稳态，因此被认为是人类最重要的抗炎细胞因子之一。此外，它还抑制TNF-α、IL-10和IFN-r等促炎细胞因子的分泌，使巨噬细胞失活，减少巨噬细胞、T细胞和B细胞的增殖和分化，并防止过度的免疫反应和组织损伤。我们推测茯苓多糖处理后，IL-10和TNF-α水平显著增加改善了肠道屏障的完整性和功能，防止毒素和细菌入侵，并减少炎症反应。茯苓广泛用于中国传统饮食和药用文化；因为它在中医中通常以水煎剂的形式服用来治疗疾病；因此PCX作为茯苓的主要成分被摄入肠道，而残渣中的PCY通常被丢弃，忽略了PCY强大的益生元作用。以上结果提示我们应该关注PCY的潜在价值，它可能被开发成一种新的医药产品。

虽然我们目前的研究并不详尽，我们没有在动物实验中对高剂量和低剂量的多糖和三萜皂苷进行分组，或创建带有疾病的动物模型，以验证茯苓的药理作用。在进一步的研究中，我们计划建立病理动物模型，研究茯苓不溶性多糖对肠道菌群的影响机制，并应用基于SCFAs的靶向代谢组学方法来深层探索代谢物的差异。综上所述，结果表明PCY显著改变了肠道菌群落的结构，多糖和三萜皂甙都会引起粪便中代谢物组成的差异。具体来说，口服PCY可以改变肠道菌群的结构和丰度，以及肠道代谢物的组成。

结论

总之，我们的研究应用16S rRNA HTS和代谢组学方法来确定茯苓的三种主要代谢物对小鼠肠道菌群的影响。我们得出结论，就本研究中对肠道菌群调节的药理作用而言，PCY是茯苓的有效生物活性成分。PCY通过改变其组成和结构显著调节小鼠肠道菌群，而PCX和PCZ导致微生物组略有不同。PCY显著增加了益生菌乳酸菌的数量（p < 0.01）。此外，代谢组学结果表明，茯苓三种主要活性代谢物显著改变了肠道代谢物中短链肽的含量。总的来说，本研究进一步研究了来自茯苓的三种主要代谢物对调节肠道菌群的药理作用。我们的研究结果表明，PCY是一种重要的益生元，可以开发成一种新的益生元产品；开发该产品将有助于确保茯苓的潜在药用价值得到充分开发和利用。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35991887/