《食品科学》：茅台学院酿酒工程系唐佳代讲师等：不同感官特性酱香大曲真菌群落结构与理化特性

酱香大曲以小麦、水和母曲为原料，经发酵贮存制成，在酱香型白酒生产过程中起到微生物制剂、复合酶制剂和风味物质载体等作用。作为微生物制剂，酱香大曲中微生物主要包括酵母菌、霉菌、细菌和放线菌，在发酵过程中产生蛋白酶、脂肪酶、糖化酶、纤维素酶等丰富多样的酶系，具有酒化、酯化等能力，从而促进酒中多种风味物质的形成。近年来，高通量测序技术因其安全性和可靠性高，能全面展现样本微生物多样性、群落结构及丰度等优势，普遍被应用于白酒领域。

茅台学院酿酒工程系的唐佳代、龙亚飞和贵州茅台酒股份有限公司的刘力萍等人基于高通量测序分析不同感官特性酱香大曲中真菌群落结构，结合不同感官特性酱香大曲理化指标，分析其微生物群落结构与理化、发酵特性的关联性。同时，掌握更多酱香型白酒酿造过程中的真菌信息，以期为进一步利用白酒酿造微生物资源奠定研究基础。

01.

不同感官特性酱香大曲理化特性分析

如表1所示，不同感官特性酱香大曲样品中水分质量分数分别为白曲12.89%、黄曲11.63%、黑曲12.44%，均低于13%。样品酸度由高到低依次为黑曲＞白曲＞黄曲，分别为白曲0.262 mmol/g、黄曲0.252 mmol/g、黑曲0.316 mmol/g。不同感官特性大曲样品液化力由高到低依次为黄曲＞白曲＞黑曲，糖化力由高至低为白曲＞黄曲＞黑曲，发酵力由高到低依次为黄曲＞黑曲＞白曲，酯化力高到低依次为黄曲＞黑曲＞白曲。3 种大曲样品的理化指标差异主要体现在液化力和糖化力，两指标越高代表大曲对原料中淀粉转化率越高。酯化力和发酵力属于大曲生化功能的动态指标，与大曲中微生物多样性及其代谢有密切联系。综合来看，黄曲各项指标更符合实际生产要求。

02.

不同感官特性酱香型大曲真菌多样性分析

酱香型大曲样品提取基因组DNA后，对ITS区进行测序，进行双端拼接获得到优质序列，优质序列再经过滤嵌合体后共获得386 150 条有效序列，平均长度为366 bp。Venn图可直观展现不同感官特性酱香大曲样品中的共有OTU和特有OTU，由图1可知，3 种样品共同的OTU有273 个，黄曲样品特有的OTU为237 个，白曲样品特有OTU为135 个，黑曲样品特有OTU为203 个。

OTU数稀释曲线（图2）反映了样本物种丰富度随测序深度的变化趋势，以及持续抽样下新物种出现的速率。该曲线以样本中随机抽取一定数量序列数与序列所代表的物种数绘制的曲线。图2中黄曲、白曲和黑曲样品的稀释曲线前期急剧上升，随着抽取序列的增加后趋于平缓。该结果表明抽取序列前期随着抽取序列数增加，检出大量真菌物种；当抽检超过20 000 个序列后，真菌物种不再随测序数量的增加而显著增多，表明样本测序量充分，测序结果能真实反映不同感官特性酱香大曲的真菌多样性。

在97%一致性水平上进行大曲样品 α 多样性指数值分析，结果如表2所示。覆盖率与样本中物种被测出的概率呈正比，各样本覆盖率均大于0.98，认为测序结果能够真实反映样品物种丰度及物种多样性。在不同感官特性酱香大曲中，黄曲样品的Chao1、ACE、Shannon指数和Simpson指数均最高，说明黄曲中物种分布较为均匀且检测出物种总数最高。真菌群落多样性和真菌总数由高至低依次为：黄曲＞黑曲＞白曲。

03.

不同感官特性酱香大曲真菌群落结构分析

如图3所示，酱香大曲样品中丰度水平前10的物种有曲霉属（ Aspergillus ）、枝孢属（ Cladosporium ）、球针壳属（ Phyllactinia ）、嗜热子囊菌属（ Thermoascus ）、丝衣霉菌属（ Byssochlamys ）、根霉属（ Rhizopus ）、酵母属（ Saccharomyces ）、亚隔孢壳属（ Didymella ）、青霉属（ Penicillium ）和粪盘菌属（ Ascobolus ）。黄曲中相对丰度超过1%有 Aspergillus （33.84%）、 Cladosporium （12.48%）、 Phyllactinia （11.05%）、 Rhizopus （1.83%）、 Saccharomyces （1.78%）、 Ascobolus （1.47%）、 Penicillium （1.35%）、 Didymella （1.33%）和 Toxicocladosporium （1.25%）。白曲中丰度超过1%的包括 Aspergillus （37.92%）、 Thermoascus （20.71%）、 Byssochlamys （13.33%）、 Cladosporium （2.29%）、红曲霉属（ Monascus ）（1.32%）、丝孢毕赤氏酵母属（ Hyphopichia ）（1.22%）、 Rhizopus （1.21%）、 Millerozyma （1.13%）、伊萨酵母属（ Issatchenkia ）（1.09%）。黑曲中相对丰度超过1%有 Aspergillus （39.55%）、 Cladosporium （13.64%）、 Phyllactinia （11.52%）、 Saccharomyces （2.42%）、 Rhizopus （1.96%）、 Ascobolus （1.44%）、 Penicillium （1.40%）、 Didymella （1.26%）、 Toxicocladosporium （1.26%）。

为探究不同大曲样品组在高丰度类群上的相似性程度，选取丰度排名前50的属，从物种和组两个层面进行聚类分析，并绘制成相对丰度聚类热图（图4）。如图4所示，横向聚类结果显示黄曲与黑曲样品间枝长较短、距离较小，表明其物种丰度相似度较大，白曲与黄曲、黑曲间距离较大，表明其物种丰度相似度较低。

主成分分析如图5所示，PC1、PC2分别占80.3%、6.9%，共能解释87.2%的物种差异。黄曲与黑曲样品在PC1上距离较小，说明黄曲与黑曲样品间真菌群落结构较为相似；白曲与黄曲、黑曲之间在PC1上距离较远，说明白曲与黄曲、黑曲样品组间真菌群落结构在属水平上有较大差异。

通过LEfse分析（图6），从不同感官特性酱香大曲中检出6 个真菌类群，其中属于高丰度菌属的有黑曲中的Saccharomyces、白曲中的Thermoascus和Byssochlamys。造成不同感官特性酱香大曲真菌群落结构差异的主要是Saccharomyces、Thermoascus、Byssochlamys和若干丰度较低的菌属。

04.

结 论

采用高通量测序分析对比不同感官特性的酱香大曲的真菌群落结构，并分析与其理化特性之间的关联性。由于在曲房堆积贮存过程中温度与湿度差异，酱香成品曲表现为不同感官特性。所测不同感官特性酱香大曲样品中水分含量、酸度均符合相关标准。样品间黄曲的液化力、发酵力和酯化力均较高，液化力由高到低依次为黄曲＞白曲＞黑曲，发酵力和酯化力由高到低依次为黄曲＞黑曲＞白曲，糖化力由高至低为白曲＞黄曲＞黑曲。大曲的液化力和糖化力主要与其中细菌、霉菌及其代谢相关，发酵力和酯化力主要与酵母菌相关，继而展开3 种酱香大曲中真菌群落及多样性差异分析。

通过在UNITE分类学数据库比对，结果显示在酱香大曲样品中鉴别出丰度优势真菌属：黄曲中为Aspergillus、Cladosporium和Phyllactinia；白曲中为Aspergillus、Thermoascus和Byssochlamys；黑曲中为Aspergillus、Cladosporium和Phyllactinia。样品菌属丰度最高的均为Aspergillus，该结果与已有研究结果相印证。Aspergillus具有耐热和耐酸特性，在酱香大曲和酿酒环境中种类最为丰富的霉菌，可产生淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，有利于提高酒曲的液化力、发酵力和酯化力。在高丰度菌属中黄曲丰度优势真菌属与黑曲相似度较高，丰度前3的菌属相同；白曲样品的丰度优势菌属与黄曲、黑曲有一定程度差异。PCA与菌属聚类丰度热图结果表明，黄曲与黑曲样品在PC1上样品间真菌群落结构较为相似且物种丰度相似度较大；白曲与黄曲、黑曲样品组间真菌群落结构在属水平上有较大差异，且物种丰度相似度较低。为探究3 种不同感官特性酱香大曲中真菌群落结构差异，应用LEfse分析进行组间类群的差异检验，找到组间差异显著的物种。LEfse分析结果显示，造成不同感官特性酱香大曲真菌群落结构差异的主要是Saccharomyces、Thermoascus、Byssochlamys和一些丰度较低的菌属。Saccharomyces与酒曲酒化力、发酵力与酯化力息息相关，初步判断在优势菌属同为Aspergillus条件下，Saccharomyces所造成菌属差异是造成黄曲和黑曲酒化力、发酵力与酯化力较高的主要因素，发酵过程能够产生较多的醇类、酯类和醛类等风味化合物，而黑曲本身的焦糊味较重，大量投用不利于白酒风味，故在生产中投用黄曲比例最大。Thermoascus、Byssochlamys和Rhizopus等在大曲样品中丰度较高菌属可产生阿魏酸酯酶、α-淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等生物活性酶类，促进白酒中风味成分和健康因子的生成与富集。

基于高通量测序技术结合理化指标分析，初步探究了不同感官特性酱香大曲理化特性差异与真菌多样性与群落结构差异间的关联性。进一步将完善不同感官特性酱香大曲中微生物组学与风味组的相关性研究，获取酱香大曲中功能微生物，为提高酱香大曲发酵性能奠定理论与物质基础。

本文《不同感官特性酱香大曲真菌群落结构与理化特性》来源于《食品科学》2022年43卷14期193-198页，作者：唐佳代, 刘力萍, 龙亚飞,孟卓妮，吴德光，张春林。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210813-177。点击下方 阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑/责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网。

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