2区-if6.3+:大连工大&西北大学揭示枸杞阿拉伯半乳聚糖对DSS诱导慢性结肠炎小鼠模型粪便代谢组的影响

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导读

溃疡性结肠炎 (UC)通常伴有肠道微生物群和代谢的失调。我们先前的研究表明，来自枸杞 (Lycium barbarum)中的阿拉伯半乳聚糖 (LBP-3)可以通过调节肠道微生物群的结构显著减轻小鼠慢性UC的症状。本研究通过HPLC-TripleTOF/MS探讨了LBP-3对同一批小鼠粪便样本代谢谱的影响。非靶向代谢组学分析表明，补充LBP-3显著逆转了葡聚糖硫酸钠 (DSS)干扰的48种差异代谢产物中的18种产物 (主要属于氨基酸和有机酸)。靶向代谢组学显示，由DSS诱导引起色氨酸、赖氨酸、二碘甲状腺氨酸、犬尿氨酸和甜菜碱水平降低，苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、高丝氨酸、(S)-2-羟基戊二酸、2-异丙基苹果酸、抗坏血酸、葡萄糖酸和牛磺酸水平升高，均可被LBP-3治疗逆转。此外，途径分析表明，磷酸戊糖途径、苯丙氨酸代谢途径、抗坏血酸和醛酸代谢途径以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途径受到 LBP-3的显著影响。更重要的是，由LBP-3改变的上述氨基酸和有机酸代谢途径与肠道微生物群的丰度相关，如Turicibacter、乳杆菌属 (Lactobacillus)、副萨特氏菌 (Parasutterella)、嗅杆菌 (Odoribacter)、韦荣氏球菌 (Veillonella)、粪杆菌 (Faecalibacterium)和瘤胃菌科 (Ruminococcaceae)。本研究促进了我们对LBP-3治疗DSS诱导的慢性结肠炎后肠道微生物组和代谢组之间相互作用的理解。

论文ID

原名：Impact of Lycium barbarum arabinogalactan on the fecal metabolome in a DSS-induced chronic colitis mouse model

译名：枸杞阿拉伯半乳聚糖对DSS诱导的慢性结肠炎小鼠模型粪便代谢组的影响

期刊：Food & Function

IF：6.317

发表时间：2022.07

通讯作者：宋爽 & 黄琳娟

通讯作者单位：大连工业大学食品学院 & 西北大学食品科学与工程学院

实验设计

实验结果

1. LBP-3治疗后的肠道微生物群分析

我们通过16S rRNA测序分析各组小鼠的粪便微生物组成。正常组、DSS组、ASA组和LBP-3组的clean reads数分别为80123 ± 70、80127 ± 45、80124 ± 51和80199 ± 69，根据测序数据可以直接反映这些样品的合理性 (图S1)。如图1A所示，与正常组相比，在门水平上DSS组的变形菌门 (Proteobacteria)相对丰度显著升高 (p < 0.05)，而ASA和LBP-3处理可将其逆转至正常水平。此外，与正常小鼠相比，在DSS诱导的小鼠中观察到乳杆菌属(Lactobacillus)、嗅杆菌 (Odoribacter)、Alistipes、副拟杆菌 (Parabacteroides)、Candidatus_Saccharimonas和瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)的相对丰度显著下降，Turicibacter、拟杆菌 (Bacteroides)、副萨特氏菌 (Parasutterella)和罗姆布茨菌 (Romboutsia)的相对丰度显著增加。相比之下，这些改变在ASA或LBP-3的治疗下得到部分恢复(图1B)。

图1 基于16S rRNA测序在门水平和属水平上对LBP-3改变的肠道菌群进行分析 (n = 6)。

2. 利用非靶向代谢组学鉴定差异代谢物

为了揭示DSS诱导的慢性结肠炎小鼠肠道微生物群的代谢变化，我们使用HPLC TripleTOF分析了不同处理后所有小鼠的粪便样本。OPLS-DA评分图显示了正常组与DSS组、ASA组与DSS组以及LBP-3组与DSS组之间的代谢差异，并且每组都进行了聚类，显示出良好的重复性 (图2)。我们应用OPLS-DA模型对数据进行200次随机迭代排列测试以检验其拟合优度和可预测性 (图S2)。在本研究中，VIP大于1.0的化合物，折叠变化 (FC) ≥ 1.2或FC ≤ 0.833和P值 < 0.05被确定为差异代谢物。如表1和表S6和S7所示，与DSS组相比，正常组、ASA组和LBP-3组分别有48、16和31种差异代谢物。此外，与正常小鼠相比，在DSS诱导的小鼠中，48种差异代谢物中的30种和18种分别显示出明显的增加和减少。然而，LBP-3显著调节了48种差异代谢物中的19种，使18种差异代谢物恢复正常水平，而ASA显著调节了18种差异代谢物中的10种，逆转了9种差异代谢物。此外，这些差异代谢物的差异贡献度在热图中展示出来。如图3所示，我们鉴定出35种有机酸、10种氨基酸及其衍生物、6种嘌呤、吡啶及其衍生物、4种糖及其衍生物以及12种其它化合物。在上述67种代谢物中，粪便样本代谢物的变化主要分布在有机酸和氨基酸中，DSS组的亮氨酸、牛磺酸、琥珀酸、果糖、6-磷酸氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨糖酸水平显著高于正常组，而LBP-3和ASA可以将其恢复到正常水平。

图2 在正离子模式 (A-C)和负离子 (D-F)模式下正常组vs DSS组、ASA组vs DSS组以及LBP-3 vs DSS组的粪便样本的OPLS-DA得分图 (n = 8)。

图3 在正离子 (A)和负离子 (B)模式下，粪便样本HPLC-Q-TOF/MS数据中显著改变的代谢物水平的热图。蓝色和红色分别代表与DSS组相比，正常组、ASA组和LBP-3组代谢物水平的降低和升高 (n = 8)。

表1 LBP-3组与DSS组粪便样本中差异代谢物鉴定结果

注：P值使用错误发现率 (FDR)校正的Student's t检验进行分析(*p < 0.05, **p< 0.01 and ***p < 0.001)。

3. 潜在差异性代谢物的定量分析

氨基酸、有机酸、嘌呤或嘧啶衍生物以及糖及其衍生物是非靶向分析后的主要差异代谢物。因此，我们采用靶向代谢组学来验证和补充氨基酸和有机酸等关键代谢物的结果。结果如表S8所示，共85种差异代谢物的相对浓度受DSS、ASA或LBP-3的影响发生显著变化。此外，为了显示差异代谢物在不同干预组中相对变化的程度，我们对差异代谢物进行火山图分析。结果如表S8所示，DSS、ASA或LBP-3显著改变了总共85种差异代谢物的相对浓度。此外，对火山图进行分析以显示变化代谢物特征的相对贡献。分别与正常组相比，DSS组的代谢产物有12种显著下调，36种显著上调 (图4A)；LBP-3组的代谢产物有23种显著下调，35种显著上调；而ASA组仅有5种和13种显著下调和上调的代谢产物(图4B和C)。随后对氨基酸和有机酸分析以确定由DSS、ASA或LBP-3改变的不同代谢物，结果如图5所示。与正常组相比，DSS组显著减少5个氨基酸和1个有机酸，增加6个氨基酸和15个有机酸 (p < 0.05)，而LBP-3组显著恢复了10种氨基酸和5种有机酸 (p < 0.05)，ASA组仅3种氨基酸和2种有机酸发生逆转 (p < 0.05)。

图4 正常 vs DSS (A)、ASA vs DSS (B)以及LBP-3 vs DSS (C)的差异代谢物火山图。结合变化幅度 (log 2 [FC])和统计t检验[−log 10 (p-值)]分析。蓝色代表显著下调的代谢物，红色代表显著上调的代谢物，灰色代表无显著差异的代谢产物。

图5 热图显示各组中氨基酸和有机酸的相对浓度 (n = 8)。红色表示增加，蓝色表示减少。

4. 代谢途径分析

通过气泡图进一步分析代谢途径以探究溃疡性结肠炎中明显改变的代谢产物。结果如图6A所示，与正常组相比，DSS组中变化最显著的代谢途径是甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、烟酸和烟酰胺代谢以及酮体的合成和降解。而与DSS组相比，LBP-3组中变化最显著的代谢途径是磷酸戊糖途径、抗坏血酸和醛酸代谢、苯丙氨酸代谢、酮体降解以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途径。与DSS组相比，ASA处理后变化最显著的代谢途径是酮体的合成与降解、苯丙氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及丙酮酸代谢 (图6B和C)。

图6 各处理组的KEGG途径发生显著变化。图中每个气泡代表一条代谢途径。气泡的Y坐标轴和颜色由显著差异 (log 10 P-值)的P-值确定。气泡的X坐标和半径表示其在拓扑分析中的影响，在拓扑结构和富集分析中突出的关键路径被标记出来。

5. 肠道微生物群与慢性结肠炎相关差异代谢物的相关性

Spearman相关分析用于探究溃疡性结肠炎中相关微生物 (前35种)和代谢物之间可能的关联机制。如图7所示，6种氨基酸 (苯丙氨酸、正/异亮氨酸、谷氨酰胺、高丝氨酸和同型半胱氨酸)和8种有机酸 (抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖酸、顺丁烯二酸、草乙酸、p-水杨酸、D-葡萄糖酸酯和牛磺酸)与韦荣氏球菌 (Veillonella)、肠球菌 (Enterococcus)、Butyricimonas、链球菌 (Streptococcus)、Erysipelatoclostridium、罗姆布茨菌 (Romboutsia)、Turicibacter、副萨特氏菌 (Parasutterella)和拟杆菌 (Bacteroides)呈显著正相关，与Muribaculum、罗氏菌属 (Roseburia)、瘤胃梭菌属 (Ruminiclostridium)、Candidatus_Saccharimonas和Alistipes呈负相关。此外，Muribaculum、罗氏菌属 (Roseburia)、Candidatus_Saccharimonas和Alistipes的相对丰度与犬尿氨酸和甜菜碱呈正相关。同时，色氨酸和酪氨酸与拟普雷沃菌属 (Alloprevotella)、瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)和乳杆菌属 (Lactobacillus)呈正相关，与韦荣氏球菌(Veillonella)呈负相关。

图7 肠道微生物群和显著改变的代谢物之间的Spearman秩相关性热图。红色代表正相关，蓝色代表负相关。星号代表差异显著 (*p< 0.05和** p< 0.01)。

UC涉及微生物组和代谢组紊乱。粪便是消化道形成的最终物质，因此粪便代谢组学可以提供有关微生物组如何参与UC发病机制的有意义信息。我们先前的研究表明，LBP-3可以缓解DSS诱导的小鼠结肠炎症状 (如腹泻和体重减轻)，这与肠道微生物群的组成和多样性有关。然而，对于补充来自L.barbarum的阿拉伯半乳聚糖后，肠道微生物群如何影响慢性结肠炎小鼠的代谢变化，目前尚不清楚。本研究除了考虑微生物群中的特定微生物外，还进行了粪便中非靶向和靶向LC-MS代谢组学分析，以研究LBP-3改变的代谢组学和代谢途径，阐明LBP-3抗UC的可能机制。

许多研究已经确定了UC患者粪便中的代谢差异，在这些代谢产物中氨基酸和有机酸的改变取决于结肠炎的程度。从非靶向代谢组学的结果来看，DSS诱导的小鼠的粪便代谢谱与正常小鼠明显不同。与结肠炎小鼠相比，LBP-3改变的差异代谢物基本上属于有机酸、氨基酸、糖类、嘌呤、嘧啶及其衍生物，这与先前的研究一致。值得注意的是，氨基酸是改善肠粘膜完整性和维持肠屏障功能的必需营养素。据报道，UC患者和动物粪便中的精氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺和组氨酸的水平呈上升趋势，这似乎是炎症进展的一个结果。苯丙氨酸被推荐作为诊断活跃期或缓解期IBD患者的潜在标志物。在本研究中，LBP-3和ASA均将较高水平的L-组氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酰胺逆转至正常水平，LBP-3似乎比ASA更有效，这与之前的研究一致。

此外，一些研究发现，DSS处理的小鼠中色氨酸和酪氨酸水平低于相应的对照小鼠。色氨酸缺乏可导致结肠炎的发生和加重，且研究发现IBD患者粪便中色氨酸水平降低。Kim等人的研究证实，在正常饮食中添加色氨酸对DSS诱导的仔猪结肠炎具有治疗作用。此外，补充不易消化的碳水化合物 (如低聚果糖和抗性淀粉)不仅促进了碳水化合物的代谢，而且减少了仔猪肠道中色氨酸的降解和吲哚化合物含量。此外，色氨酸水平与慢性活动性炎症的生物标志物 (如IL-6和C反应蛋白)呈负相关，从而调节肠道炎症。色氨酸也是反映经常使用英夫利西单抗进行生物治疗的IBD患者的候选标志物。同时，色氨酸还可以通过肠道微生物群代谢成犬尿氨酸和吲哚。特别是吲哚及其衍生物可促进天然免疫细胞局部分泌抗炎白细胞介素-22，并调节肠道屏障功能。因此，LBP-3可能抑制DSS诱导的慢性结肠炎中的微生物色氨酸降解和吲哚水平，进而影响循环色氨酸池并调节宿主的免疫-炎症反应。UC患者谷氨酰胺和酪氨酸水平较高与甜菜碱、脂质和其它代谢物水平较低有关。值得注意的是，谷氨酰胺与抗坏血酸的结合在UC的发展过程中是必要的，其在氧化应激的防御机制中起着至关重要的作用。上述发现与牛磺酸的高水平一致，因为它们具有抗炎和抗氧化作用。此外，对健康对照组和UC患者之间差异代谢物的途径分析表明，几种氨基酸代谢途径 (如色氨酸代谢和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢)和抗氧化防御途径 (如谷胱甘肽途径)受到显著干扰。因此，LBP-3还影响苯了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成。

有机酸的异常也参与炎症的调节。例如，在UC患者中发现了高水平的乳酸，这可能是由肠道微生物群如乳酸杆菌 (Lactobacilli)和肠球菌 (Enterococci)产生的。次级胆汁酸牛磺胆酸及其衍生物来源于结肠中细菌转化的胆汁酸，可为变形菌门(Proteobacteria)的增殖提供硫源，从而增加肠道炎症的发生。由此可见，LBP-3和ASA降低了变形菌门 (Proteobacteria)的相对丰度，可能是由于牛磺胆酸-3-硫酸和牛磺脱氧胆酸-3-硫酸水平较低引起的。同时，在UC患者中也检测到牛磺酸增加的趋势。Levy等人发现，在给无菌小鼠和野生型小鼠使用广谱抗生素治疗时，有机酸牛磺酸作为粘膜炎症体激活剂未能降低结肠炎的严重程度。途径富集分析也显示了LBP-3对与抗坏血酸和醛酸代谢以及牛磺酸和次牛磺酸代谢相关代谢途径的影响。在IBD患者的粪便中，主要来源于肠道微生物群的碳水化合物发酵的短链脂肪酸 (SCFAs，如乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐)含量降低。多项研究已经证实，乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的单独或混合给药可减轻DSS诱导的结肠炎小鼠的结肠炎症甚至可减轻结肠炎相关的结直肠癌。SCFAs可以通过抑制组蛋白脱乙酰酶的活性调节芳香烃受体 (AHR)的功能，进而通过色氨酸衍生物来调节AHR的活性，从而调节色氨酸代谢。经证明，用LBP-3或ASA处理可提高并逆转乙酸、丙酸和丁酸的比例。在我们先前的研究中，上述SCFAs与瘤胃菌科 (Ruminococcaceae)、Butyricimonas、拟普雷沃菌属 (Alloprevotella)、Alistipes、帕拉普氏菌属 (Paraprevotella)和Candidatus_Saccharimonas呈正相关。此外，除氨基酸和有机酸代谢，相关研究发现UC小鼠体内嘌呤和嘧啶代谢水平显著降低，本研究补充LBP-3也提高了UC小鼠体内嘌呤、嘧啶及其衍生物水平。

肠道微生物群的失衡与UC整体代谢功能中微生物代谢组的改变直接相关。在结肠炎和AOM/DSS诱导的结肠炎相关癌变中，病原体Turicibacter细菌被确定为一个关键的分类群，并与炎症程度呈正相关，这与基于色氨酸代谢的5-羟色胺水平有关。色氨酸与瘤胃梭菌属 (Ruminiclostridium)、Muribaculum和乳杆菌属 (Lactobacillus)呈显著正相关。事实上，LBP-3和ASA处理组降低了Turicibacter的水平，提高了瘤胃球菌科 (Ruminococcaceae)和乳杆菌属 (Lactobacillus)的丰度，并调节了色氨酸代谢。另外，作为L-半胱氨酸的高消耗者，副萨特氏菌 (Parasutterella)的定植可显著增加牛磺酸和N-乙酰蛋氨酸的水平。值得注意的是，LBP-3和ASA治疗显著降低了副萨特氏菌 (Parasutterella) (属于变形菌门 (Proteobacteria))的相对丰度，从而降低了半胱氨酸、牛磺酸和炎性细胞因子 (如TNF-α和IL-1β)的水平，这与先前的研究一致。此外，嗅杆菌 (Odoribacter)可以生成丁酸，在肠道环境中具有活跃的戊糖磷酸途径和色氨酸代谢能力。如我们预期的那样，LBP-3和ASA处理显著提高了嗅杆菌 (Odoribacter)的丰度以及丁酸和色氨酸的含量。尤其值得一提的是，LBP-3改善了戊糖磷酸途径。因此，我们推测LBP-3可以通过逆转肠道微生物群的相对丰度 (如Turicibacter、乳杆菌属 (Lactobacillus)、副沙门氏菌 (Parasutterla)、嗅杆菌 (Odoribacter)、韦荣氏球菌 (Veillonella)、粪杆菌 (Faecalibacterium)和瘤胃菌科 (Ruminococcaceae))来调节氨基酸 (如色氨酸)和有机酸 (如牛磺酸和SCFA)。

LBP-3对慢性UC的保护机制可以总结如下：LBP-3通过提高共生细菌 (如嗅杆菌 (Odoribacter))的丰度和减少病原菌 (如Turicibacter和大肠杆菌(E. coli))来调节DSS诱导的肠道微生物群失调。同时，肠道微生物群可直接或间接的利用LBP-3产生有利的代谢产物 (如色氨酸和SCFA)，并减少促炎代谢产物 (例如牛磺胆酸和琥珀酸)。如前所述，色氨酸和SCFAs均能改善上皮屏障功能，并调节宿主免疫-炎症反应。更重要的是，虽然已经鉴定出许多差异代谢物 (如苯丙氨酸和牛磺酸)，但它们的功能以及LBP-3改变的相关肠道微生物群尚未得到验证。以下实验方法可验证关键差异代谢物或肠道微生物分类群的功能：(a)在上皮细胞中添加关键代谢产物；(b)对动物模型进行关键代谢物灌肠/注射；(c)用受体基因敲除/沉默处理细胞或动物；(d)将粪便菌群 (FMTs)移植到小鼠模型；和 (e)潜在物种的分离、实验室培养和小鼠模型的口服给药，以进一步研究表型 (如症状)和功能 (如肠道屏障功能或固有肠道微生物群)的关系。在图S3中提出了相关验证的路线图。

结论

总之，本研究揭示了慢性结肠炎小鼠的粪便代谢谱对补充LBP-3的反应。DSS诱导显著改变了48种差异代谢物 (主要属于氨基酸和有机酸)，而补充LBP-3或ASA分别显著逆转了18或9种差异代谢物。靶向代谢组学显示，LBP-3可以逆转DSS诱导干扰的特定氨基酸 (如色氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸)和有机酸 (如2-异丙基苹果酸、 (S)-2-羟基戊二酸、抗坏血酸、葡萄糖酸和牛磺酸)。代谢分析表明，LBP-3改变的主要代谢途径是磷酸戊糖途径、苯丙氨酸代谢途径、抗坏血酸和醛酸代谢途径以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途径。此外，LBP-3改变的上述代谢物和代谢途径与肠道微生物群的组成相关 (如Turicibacter、乳杆菌属 (Lactobacillus)、副萨特氏菌 (Parasutterella)、嗅杆菌 (Odoribacter)、韦荣氏球菌 (Veillonella)、粪杆菌 (Faecalibacterium)和瘤胃菌科 (Ruminococcaceae))。本研究为从L.barbarum获得的阿拉伯半乳聚糖的抗UC药理机制提供了新的见解。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35912853/

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